猪传染性萎缩性鼻炎(Swine infectious atrophic rhinitis, AR),是猪的一种严重的、广泛流行的、接触性上呼吸道疾病;其主要危害是致鼻甲骨萎缩变形、饲料转换率降低、生长速度下降、其它病原如猪繁殖与呼吸综合征病毒的继发感染等。现在一致认为:Ⅰ相支气管败血波氏杆菌(Bordetella bronchisepatica, Bb)和产毒素多杀性巴氏杆菌(toxingenic Pasteurella multocida, T~+Pm)是该病原发性的病原;且产毒多杀性巴氏杆菌毒素(Pasteurella multocida toxin, PMT)是其最主要的致病因子,该毒素是由toxA基因编码的一种皮肤坏死毒素(dermonecrotic toxin, DNT),其毒力很强。目前随着集约化程度的不断提高,该病对养猪业的危害也日趋严重;因此,用于快速准确地检出其毒素的诊断方法的建立将为该病的防制提供科学根据。 本课题以本室保存的产毒多杀性巴氏杆菌toxA基因羧基端(C端)原核表达质粒pET28bC2115为研究材料,开展了检测产毒多杀性巴氏杆菌毒素抗体的乳胶凝集方法的研究。 本研究内容如下: 1.本研究将产毒多杀性巴氏杆菌的toxA基因原核表达质粒pET28bC2115转化大肠杆菌BL21,该基因在大肠杆菌中以包涵体的形式获得高效表达;表达蛋白约78kDa,Western-blot检测表明,表达蛋白具有生物活性。 2.通过碳化二亚胺的化学偶联作用、以最佳致敏条件致敏纯化蛋白,制备该毒素乳胶诊断抗原;并进行了特异性试验和重复性试验,结果表明该方法具有较好的特异性和重复性;并对研制出的乳胶诊断抗原试剂进行了保存期试验,该试剂在4℃可保存6个月以上、室温可保存3个月以上,说明其特性比较稳定。 3.用该方法与本室建立的检测PMT抗体的ELISA方法同步检测9个猪场83份送检血清,总符合率为94.0%(78/83),两种方法检测结果差异不显著(P>0.05);从而建立了一种快速准确检测PMT抗体的乳胶凝集方法。 4.用所建立的方法检测了1680份来自广州、福建、上海、湖南、湖北、山东等省市地区送检血清,其中阳性检出份数为467份,总阳性检出率为28.3%,一月份的血清样品检出的阳性率最高,达33.7%,且仔猪与种猪群阳性检出率高于其它群体;此结果与该病的流行病学特点相一致。 本研究初步建立了一种检测产毒多杀性巴氏杆菌毒素抗体的乳胶凝集试验方法,通过将其与本实验室建立的ELISA方法的对比试验说明该方法特异性较高、重复性好,该乳胶抗原也较稳定,便于运输保存;通过该方法的临床应用检测,说明该方法准确快速、简便特异,有利于临床上对该毒素抗体的快速检出,为猪萎缩性鼻炎的快速诊断以及将来的净化和根除奠定了基础。