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大刺鳅(Mastacembelus armatus)属于合鳃目(Symbranchiformes)刺鳅科(Mastacembelidae)刺鳅属(Mastacembelus)。近年来由于捕捞过度,野生大刺鳅群体逐渐萎缩。有关人工养殖大刺鳅研究方面的报道较少,对大刺鳅生长内部分子机制的研究尚未见报道,为了进一步提高大刺鳅的应用价值,为后续大刺鳅全人工繁育增加基础数据,本实验,使用同源克隆和RACE法克隆了大刺鳅生长相关基因(ghrh、gh、igf-1、igf-2、mstn),研究了这些基因在大刺鳅组织、胚胎和胚后发育时期的表达情况。同时研究了在体注射不同浓度的大刺鳅GHRH多肽、LHRH-A2及RNA干扰ghrh对ghrh、gh、igf-1、igf-2、mstn m RNA表达的影响。为阐明大刺鳅各生长基因之间的调控机制奠定了理论基础。主要结果如下:1.大刺鳅ghrh、gh、igf-1、igf-2、mstn基因c DNA全长分别是1090 bp、815bp、2989 bp、1446 bp、2690 bp,开发阅读框(ORF)分别为429 bp、615 bp、558 bp、648 bp、1331 bp;分别编码142、204、185、215、376个氨基酸。5′-UTR分别是121 bp、33 bp、305 bp、117 bp、200 bp;3′-UTR分别是540 bp、167 bp、2126 bp、681 bp、1359 bp。通过软件分析:GHRH氨基酸序列具有19个氨基酸组成的信号肽,27个氨基酸组成的Hormone＿2家族成熟肽结构域。GH氨基酸具有17个氨基酸组成的信号肽,保守的4个半胱氨酸残基(Cys)。IGF-1氨基酸具有43个氨基酸组成的信号肽,56个氨基酸组成的IIGF结构域。IGF-2氨基酸具有52个氨基酸组成的信号肽,58个氨基酸组成的IIGF家族结构域和56个氨基酸组成的IGF2＿C结构域。MSTN具有22个氨基酸组成的信号肽,9个保守Cys。同源性比对分析结果显示:大刺鳅GHRH与鲈形目的大口黑鲈(Micropterus salmoides)、斜带石斑鱼(Epinephelus coioides)、黄金鲈(Perca flavescens)的序列一致性均超过90%。大刺鳅GH与斑鳜(Siniperca scherzeri)、花鲈(Lateolabrax japonicus)、黄鳝(Monopterus albus)同源度较高;分别为95.59%、95.07%、92.16%,与陆生动物的同源度仅为25.49%～33.33%。大刺鳅IGF-1与其他脊椎动物IGF-1序列同源性为:48.37%～94.05%,其中与鲈形目的黄鳍鲷(Acanthopagrus latus)、斜带石斑鱼、金钱鱼(Scatophagus argus)的序列一致性均超过90%。大刺鳅IGF-2与其他脊椎动物IGF-2序列同源性为:44.44%～92.09%,其中金钱鱼的序列一致性均最高(90.09%)。大刺鳅MSTN与尖吻鲈(Lates calcarifer)、大黄鱼(Larimichthys crocea)、斑鳜同源度较高;分别为94.68%、93.09%、92.55%。所有氨基酸系统发育分析显示大刺鳅与黄鳝、鲈形目鱼类聚在一大支。说明大刺鳅与黄鳝、鲈形目鱼类亲缘关系较近。2.采用real time q PCR方法检测了大刺鳅ghrh、gh、igf-1、igf-2、mstn m RNA在大刺鳅成鱼脑、肌肉、心脏、肝脏、肾脏、脾脏、胃、肠、眼、鳃和卵巢,精巢组织中的表达情况。结果显示:ghrh m RNA只在脑中高表达,其他组织表达量极低。gh m RNA在脑中表达量最高,其次为肝脏、肌肉、性腺和心脏,肠道中表达量最低。大刺鳅igf-1 m RNA和igf-2 m RNA都在肝脏中高表达,其他组织也有少量表达。大刺鳅mstn m RNA在肌肉中表达量最高,其次为眼、脑、性腺和心脏,鳃中表达量最低。3.采用real time q PCR方法检测了大刺鳅ghrh、gh、igf-1、igf-2、mstn m RNA在大刺鳅胚胎和胚后发育过程的表达情况。结果表明:大刺鳅ghrh m RNA在胚胎发育各阶段表达量极低,几乎不表达,在胚后发育各时期有逐步上升的趋势。大刺鳅胚胎发育各个阶段均检测到gh m RNA的表达,囊胚期表达量较高,其次为原肠胚期,肌节出现期和出膜期表达量较低。胚后发育中gh基因表达量相对稳定。大刺鳅两种igf m RNA在胚胎各发育时期都有表达,胚后发育各阶段表达量有逐步升高的趋势。在大刺鳅胚胎和胚后发育各个时期均检测到mstn m RNA的表达,其中,囊胚期表达量最高,原肠胚期次之,肌节出现期和出膜期mstn表达量较低。胚后发育呈现逐渐递增的趋势。4.注射大刺鳅GHRH多肽对大刺鳅脑ghrh m RNA表达量具有抑制作用,对大刺鳅脑gh m RNA表达量具有明显的促进作用。中高浓度GHRH多肽对肝脏igf-1 m RNA和igf-2 m RNA表达量具有明显的促进作用。大刺鳅GHRH多肽对大刺鳅肌肉mstn m RNA表达水平影响较小。以上结果说明短时间内增加GHRH对gh、igfs的表达具有显著的影响。5.注射LHRH-A2对大刺鳅脑ghrh m RNA表达量没有显著影响。注射LHRH-A2对大刺鳅脑gh m RNA表达量具有极明显的促进作用。注射LHRH-A2对大刺鳅肝脏igf-1 m RNA表达量具有促进作用,但没有显著差异(P>0.05)。注射LHRH-A2对大刺鳅肝脏igf-2 m RNA表达量具有促进作用。LHRH-A2对大刺鳅肌肉mstn m RNA表达水平影响较小,以上结果说明LHRH-A作为Gn RH类似物对gh、igfs的表达具有一定影响。6.经GHRH si RNA干扰后,大刺鳅ghrh基因转录水平下降,对生长激素gh基因的表达具有明显抑制作用。gh基因表达量低于对照组,大刺鳅igf-1 m RNA和igf-2 m RNA表达量低于对照组,注射大刺鳅GHRH si RNA 3h～12小h,大刺鳅mstn m RNA表达量与对照组没有显著差异。