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由条形柄锈菌(Puccinia striiformis f. sp. tritici)引起的小麦条锈病是影响世界小麦生产重要病害之一。实践证明,选育并合理利用抗病品种是控制小麦条锈病经济、安全、有效的方法。开展小麦与条锈菌互作的分子机理研究,为揭示病原物的致病机理和寄主植物的抗病机制奠定基础,同时也为小麦抗条锈品种的合理利用及病害的可持续控制提供了重要理论依据。本实验室已构建了小麦品种水源11与条锈菌生理小种CY23非亲和互作的抑制性差减杂交文库,获得大量差异表达基因。本论文的第一部分从中挑选了3个候选基因,通过RACE技术克隆这3个基因,通过生物信息学分析基因的基本特征,利用qRT-PCR分析基因表达特征,运用BSMV-VIGS技术对其中1个基因进行了功能分析。通过这些实验,初步揭示了这三个基因在小麦与条锈菌互作过程中的分子生物学的功能。此外,由于条锈菌毒性变异频繁使新的毒性小种不断出现,导致小麦抗病品种在应用过程中抗锈性丧失。因此,发掘新的抗病资源和新的抗病基因的分子标记,则是抗病育种一个迫切的任务。本论文的第二部分就是从四倍体小麦中开发新的抗病基因并对其进行了分子标记。具体内容如下：1.小麦受体蛋白激酶TaLRPK,编码一个1045aa富含亮氨酸重复的受体蛋白激酶。TaLRPK具有典型的LRR受体激酶结构域,其包含一个信号肽,19个LRR重复,一个跨膜区,一个胞内受体激酶区,与Xa21氨基酸序列相似度为42%。洋葱表皮细胞的瞬时表达实验,显示TaLRPK蛋白定位在细胞膜上。半定量RT-PCR结果显示,TaLRPK在小麦叶组织中特异表达。TaLRPK在小麦与条锈菌互作的亲和组合中呈上调表达。在外源激素处理以及环境因子等处理均可以影响其表达。通过BSMV-VIGS对TaLRPK进行了诱导沉默,导致条锈菌孢子产生减少以及HR反应的出现。这些结果表明TaLRPK基因在小麦应对环境胁迫和条锈菌致病过程中发挥了作用。2.小麦顺式还原酮加双氧酶基因TaARD,包含一个597bp的开放阅读框,编码198个氨基酸,其氨基酸序列具有β-barrel保守结构域；氨基酸聚类分析表明,预测编码的多肽与大麦HvARD编码生成的氨基酸序列相似性高达99%,与水稻OsARD的同源性达到92%。利用中国春缺四体系,将TaARD位于4A染色体上。Southern杂交结果显示且该基因至少有六个拷贝,为多基因家族。洋葱表皮细胞的瞬时表达实验,显示TaARD蛋白分布在细胞核和细胞质中。半定量RT-PCR结果显示,TaARD在小麦根、茎、叶组织中表达量基本一致,无组织特异性。TaARD在小麦与条锈菌互作的亲和组合中呈上调表达,非亲和组合中下调表达。外源的茉莉酸甲酯先抑制其表达后诱导其表达,而在水杨酸、乙烯、脱落酸处理后下调表达。TaARD的表达水平也可被高盐、伤害以及低温等环境刺激所抑制而下调。构建的原核表达载体TaARD-pET-32a转化进宿主菌BL21(DE3),在最佳条件0.1mmol/L IPTG 25℃诱导表达24h,获得大量表达产物。经His-TrapHP亲和层析柱纯化,免疫家兔制备多克隆抗体,并对收集的抗体进行了纯化。琼脂双扩散和ELISA检测结果表明,制备的抗体具有较高的效价,并对融合表达的TaARD蛋白结合活性良好。Western杂交显示,TaARD蛋白抗体对融合表达的重组蛋白和小麦叶片中TaARD蛋白都有较强的特异性。以上结果可以表明TaARD参与小麦的甲硫氨酸代谢途径以及在乙烯信号介导的生物和非生物胁迫反应中起着重要作用。3.小麦伤诱导蛋白TaWRP,编码一个325aa蛋白,具有一个未知功能的结构域DUF51,与水稻的WRP氨基酸序列相似度为85%。半定量RT-PCR结果显示,TaWRP在小麦叶组织中特异表达。TaWRP在小麦与条锈菌互作的非亲和组合中以及SA处理呈上调表达。伤害诱导其表达,表明该基因为伤诱导蛋白。在其他外源激素JA, ET, ABA处理以及环境因子高盐等处理均可以抑制其表达。这些结果表明TaWRP基因在小麦应对环境胁迫和条锈菌抗病过程中发挥了作用。4.来自埃塞俄比亚的四倍体小麦PI480148具有良好的苗期抗性。为了标记PI480148中的抗病基因并将其导入普通小麦,本实验利用它作父本,AVS做母本进行杂交,获得杂交后代。利用Feulgen根尖染色法对F3植株进行了筛选,获得一些具有42条染色的植株。对来自同一F3植株的157株F4群体进行了抗病性鉴定,得出3：1的分离比,表明该抗性是由单一主效基因控制。随后,利用RGAP以及SSR等标记对该基因进行了分子标记,构建一个遗传距离图。YrPI480148位于2BL,其两侧最近的分子标记一个为RGA标记,一个为SSR标记(Xwmc441),距离该基因分别为2.7和5.6 cM。利用对Yr5有毒性的澳大利亚小种对PI480148进行抗病性鉴定,结果表明YrPI480148是一个新的而且具有广泛抗性的抗病基因,在生产上将具有很好的应用价值。