研究背景肿瘤转移是恶性肿瘤的重要生物学特征。肿瘤的转移是多因素、多基因相互协调作用的多阶段过程。血管生成是肿瘤转移过程中的关键性事件,抑制肿瘤血管生成能显著地抑制肿瘤的生长。抗血管生成是不同于常规抗肿瘤治疗的新策略,现在已经成为肿瘤研究热点之一。肿瘤干细胞是肿瘤转移和复发的可能机制之一。Lgr5是新近发现的小肠和结肠干细胞特异性分子标记物；做为Wnt信号通路和Hedgehog信号通路的靶基因,Lgr5在结肠癌、卵巢癌、肝癌和基底细胞癌中表达均升高。因此可以推测Lgr5在肿瘤的发生发展过程中起重要作用。但遗憾的是,目前关于Lgr5对肿瘤生成、转移的作用及其分子机制的研究还很少。本研究在前期实验研究发现Lgr5与结直肠癌组织微血管密度呈正相关的基础上,首次通过实验观察Lgr5在结直肠癌中对肿瘤血管生成的影响并初步探讨其作用机制。研究目的探讨Lgr5对肿瘤血管生成的影响及其作用机制,为干预结直肠肿瘤血管生成寻找新的靶点并提供理论依据。研究方法1.构建Lgr5 shRAN表达质粒并筛选抑制效率最高的质粒从GeneBank上查询完整的Lgr5 mRNA序列(NM 003667),用DNA重组技术设计合成4条针对Lgr5 mRNA的shRNA寡核苷酸片段,应用pGPU6/GFP/Neo质粒构建真核表达质粒Lgr5 shRNA 2230、Lgr5 shRNA 2031、Lgr5 shRNA 874、Lgr5 shRNA 450,然后将质粒通过阳离子脂质体Lipofectamine 2000转染进SW620细胞,qRT-PCR和western blot分别检测SW620细胞中Lgr5 mRNA和蛋白表达和转染效率,并筛选出干扰效率最高的质粒进行细胞生物学实验。2.划痕实验应用阳离子脂质体Lipofectamine 2000将筛选出的Lgr5 shRNA 874质粒和NC质粒分别转染进SW620细胞,转染后48h收集培养基,0.22μm滤器过滤后做为条件培养基。HMVEC细胞在6孔板中培养,待细胞生长融合后用无菌枪头划痕,形成1 mm宽的无细胞区,PBS冲洗干净脱落细胞后用收集的条件培养基培养,0h、12h、24h在倒置显微镜下观察细胞迁移情况。3. Transwell小室侵袭实验Transwell小室购自美国Corning公司。小室底部的膜材料为聚碳酸酯膜(polyearbonate, PC),做侵袭用的上室侧购买时已经铺好基质胶,小室孔径为8.0μm。生长状态良好的HMVEC内皮细胞,胰酶消化后制成单细胞悬液,无血清培养基洗涤细胞2次后,细胞计数,用无血清培养基调整细胞密度为1×106个/ml。加100μl细胞悬液于内室,然后加500μl条件培养基于下室,37℃培养24h。取出小室,吸掉上室内培养液,用棉签轻轻擦掉上室侧未穿过膜的细胞以及基质胶,4%多聚甲醛固定30 min,自然风干后结晶紫染色5 min,用蒸馏水轻轻地冲洗数次,空气中风干。在倒置显微镜下(200X)随机选取5个高倍视野,计数穿透聚碳酸酯膜的内皮细胞数。4.小管形成实验96孔板每孔铺50μl Matrigel基质胶,每孔种1×104个HMVEC内皮细胞,加入100μl收集的条件培养基,37℃、5% CO2条件下培养,8h后在倒置显微镜下观察内皮细胞形成小管样结构的情况。5.鸡胚绒毛尿囊膜实验取5日龄受精鸡胚,新洁尔灭消毒,在超净台内将鸡胚气室端(钝头端)开窗1.5×1.5 cm2大小,小心去除气室膜,暴露鸡胚绒毛尿囊膜(chick embryochorioallantoic membrane,CAM)。无菌明胶海绵裁成2×2×2mm3大小后加入20μl条件培养基,然后将明胶海绵放在鸡胚绒毛尿囊膜血管稀疏部位,用灭菌透明胶带封闭气室端,放回孵箱在38.5℃到39℃,相对湿度为65%到70%的条件下培养。72h后小心去除透明胶带,充分暴露鸡胚绒毛尿囊膜,在实体显微镜下观察放置明胶海绵部位新生血管生成情况并拍照。6.westerb blot检测SW620细胞转染Lgr5 shRNA874之后,VEGF蛋白水平表达变化。按Invitrogen公司Lipofectamine 2000产品说明书将Lgr5 shRNA874质粒和NC质粒瞬时转染进SW620细胞,转染后48小时应用western blot分别检测Lgr5和VEGF蛋白水平表达变化。结果1.质粒经测序并经序列比对后证实重组质粒序列完全正确。qRT-PCR和western blot实验发现四种质粒中Lgr5 shRNA874在SW620细胞中对Lgr5的表达抑制作用最强,(Lgr5 shRNA874在SW620细胞中对Lgr5 mRNA抑制效率达64.7%,对Lgr5蛋白表达水平的抑制达44.5%)2.划痕实验显示,Mock对照组和NC对照组在培养24h后内皮细胞明显向无细胞区移行,划痕区明显变窄,而Lgr5 shRNA874组则较少细胞进入无细胞区,划痕宽度无明显变化。3.Transwell小室侵袭实验显示,Lgr5 shRNA874组穿过Transwell小室聚碳酸酯膜的细胞数较NC组显著减少,(t=-19.744,P<0.001)。4.小管形成实验显示,应用条件培养基培养8h后,对照组HMVEC内皮细胞发生交联,形成明显的网格状结构,而Lgr5 shRNA874组内皮细胞很少发生交联,无明显的、完整的网格状结构形成,小管样结构较NC对照组显著减少(t=7.276,P=0.002)。5.鸡胚绒毛尿囊膜实验显示,NC组明胶海绵周围1 cm范围内鸡胚绒毛尿囊膜新生血管数和无血清培养基(SFM)对照组没有显著性差异,而Lgr5 shRNA874组的鸡胚绒毛尿囊膜新生血管数较NC组和SFM对照组显著减少(F=63.564,P=0.000)。6.将Lgr5 shRNA874质粒和NC质粒瞬时转染进SW620细胞48h后,检测Lgr5和VEGF蛋白表达,结果发现Lgr5蛋白表达水平被敲低后,VEGF的蛋白表达水平也降低。结论研究结果证实了Lgr5高表达促进结直肠肿瘤血管生成从而导致了转移发生。在细胞学基础上,应用RNAi抑制Lgr5表达可以抑制结直肠肿瘤血管生成。并且研究也证明了Lgr5可以通过调节肿瘤细胞分泌VEGF从而控制肿瘤血管生成。因此,在结直肠肿瘤中,Lgr5有潜力成为一个新的治疗靶点,通过抑制肿瘤血管生成从而阻止肿瘤细胞发生转移。