甘蓝是芸薹属的三个基本种之一,是一种重要的蔬菜作物,包括各种生态型及人工杂交品种,无论从进化角度还是从育种角度考虑,均需要对其进行各种细胞遗传学研究。然而,由于甘蓝的染色体很小,并且在细胞分裂期的收缩程度较其它很多植物的染色体更高和更均一,采用传统的显带技术准确鉴定全部染色体比较困难。近年来,荧光原位杂交(Fluorescencein situ Hybridization,FISH)技术飞速发展,鉴定甘蓝的染色体及核型分析工作主要是采用FISH方法,基于45S(或25S)及5S rDNA在染色体上的分布来进行核型分析。但仍未见用基因组原位杂交(Gellomic in situ Hybridization,GISH)技术对甘蓝染色体进行核型分析的报道。本研究主要采用GISH技术将甘蓝的9对染色体进行精确的鉴定区分,并与传统的核型分析方法进行对比,目的是为建立一种区分像甘蓝这样的小型染色体物种的新方法,并为研究甘蓝自交不亲和性信号传导相关基因在染色体上的定位奠定重要基础。主要实验结果如下:1.以甘蓝K164为材料,通过对染色体制片过程中重要影响因子的研究,确定了适合甘蓝染色体制片的最佳处理方法。(1)甘蓝种子萌发,当用避光变温条件培养时,其中期分裂相最多;(2)与冷处理方法相比,0.002mol/L 8-羟基喹啉18℃处理1h,染色体形态最好;(3)对比酸解、酶解、酸解+酶解、酶解+酸解处理,酶解处理条件下的染色体形态最佳。2.通过对甘蓝K164中期染色体的核型分析,得出其核型公式为2n=2x=18=4m+5sm,1号、2号、7号、9号染色体为中部着丝粒染色体,3号、4号、5号、6号、8号染色体为近中部着丝粒染色体,最长染色体与最短染色体的长度比为2.3∶1;1号染色体为长染色体,2号、3号、4号染色体为中长染色体,5号、6号、7号、8号染色体为中短染色体,9号染色体为短染色体。3.以甘蓝基因组DNA(C基因组)作为探针,白菜基因组DNA(A基因组)作为封阻剂,与甘蓝中期染色体进行GISH,通过对GISH技术重要参数的筛选,得到了最佳的分型效果。(1)在30μL杂交混合液中100%去离子甲酰胺12.7μL,探针0.5μg,封阻剂2.25μg时杂交效果最好;(2)染色体制片采用在70%甲酰胺中70℃变性2min效果最好,探针的变性为85℃变性10min,然后二者在85℃共变性10min;(3)杂交后的洗脱:基因组做探针时,洗脱强度需要强些,用2×SSC、4×SSCT和1×PBS分别在37、37和25℃下洗脱10、8和5min,原位杂交信号清晰,背景影响小;低拷贝基因做探针时,洗脱强度需要弱些,将2×SSC、4×SSCT和1×PBS的洗脱时间都减为4min,温度均为25℃,能看到杂交信号。4.采用GISH技术成功将典型自交不亲和甘蓝9对染色体进行区分,实现了对甘蓝中期染色体的精细分型研究。1号、2号和7号染色体上都有2个信号点,1号染色体上的信号点分别位于长臂和短臂上,且两信号点一强一弱,2号染色体上的2个信号点很弱,在靠近长臂臂端的位置,7号染色体上的信号点分别位于长臂和短臂,长臂上信号点靠近着丝点,短臂上信号点靠近短臂端;3号和9号染色体上都有3个信号点,3号染色体上的信号点很强,9号染色体上的信号点很弱;4号、5号、6号和8号染色体上都有一个信号点,4号和8号染色体上的信号点都位于染色体短臂的臂端,且强度相近,但4号染色体要比8号染色体长很多,5号染色体上的信号点位于短臂上很弱,6号染色体上的信号点靠近染色体的中部。5.用PCR扩增得到甘蓝类硫氧还蛋白THL1的编码基因片段,片段大小732bp,用地高辛标记为探针,与甘蓝中期染色体进行荧光原位杂交,初步将其定位在甘蓝1号染色体上,这还有待于进一步的研究确定。