牛乳铁蛋白（Bovine lactoferrin,bLF）是牛乳中一种重要的非血红素铁结合蛋白质,不仅参与Fe3+的转运与吸收,也可以作为骨生长因子,通过调控成骨细胞活性,促进骨骼生长,进而发挥其生物学功能。前期研究成骨细胞对牛乳铁蛋白的内吞作用过程中,通过分子垂钓技术显示牛乳铁蛋白与细胞骨架相关蛋白4（Cytoskeleton associated protein 4,CKAP4）具有较高的亲和性,并通过基因沉默技术证明了CKAP4可能作为bLF的受体,进而介导bLF对成骨细胞增殖活性的影响。但目前尚无相关研究表明bLF可与CKAP4的直接结合进而调控成骨细胞生长,因此研究bLF与CKAP4之间的相互作用机制对解析bLF调控成骨细胞活性的相关分子机理极为重要。本论文通过酵母双杂交技术对bLF与CKAP4的相互作用进行分析。首先在酵母菌AH109中异源表达膜外部分CKAP4以及bLF。再利用酵母双杂交技术,验证bLF与CKAP4膜外部分是否存在相互作用。以bLF为诱饵蛋白,CKAP4膜外部分为靶蛋白,结果显示bLF与CKAP4存在相互作用。在此基础上,通过交换bLF与CKAP4膜外部分的表达载体以及对CKAP4膜外部分进行截短处理,进一步确认了牛乳铁蛋白与CKAP4的相互作用。当交换bLF与CKAP4膜外部分的表达载体后,由于CKAP4膜外部分含有转录激活结构域,酵母双杂交实验中存在自激活现象;当删除CKAP4膜外部分的转录激活结构域后（CKAP4Δα）,CKAP4Δα不存在自激活现象,且bLF与CKAP4Δα仍存在相互作用。在CKAP4与bLF存在相互作用的基础上,进一步探究影响CKAP4与bLF相互作用的因素。由于bLF的空间结构及其结合Fe3+的能力受p H因素的影响,分别在不同p H条件下进行酵母双杂交实验:当p H为6、7以及9时,CKAP4与bLF存在相互作用;当p H为4.5、5以及5.5时,CKAP4与bLF不存在相互作用。为进一步探究Fe3+对CKAP4与bLF相互作用的影响,首先,添加EDTA通过螯合作用与Fe3+结合,bLF无法与Fe3+结合,其构象发生改变,通过酵母双杂交检测CKAP4与bLF不存在相互作用;并通过配制不含Fe Cl3的培养基进行酵母双杂交实验,进一步确定了Fe3+对bLF的空间构象产生影响,进而影响CKAP4与bLF之间的相互作用。在此基础上进行生物信息学分析,根据bLF与CKAP4的氨基酸序列对其进行同源建模,选取分数较高的模型构建三维结构。在构建的三维结构的基础上,对bLF与CKAP4进行分子对接,结果显示其存在6个可能结合位点,分别为bLF的ASP220与CKAP4的GLN51、bLF的GLU239与CKAP4的TYR194、bLF的ASP242与CKAP4的ARG198、bLF的ARG57与CKAP4的GLU73、bLF的ARG243与CKAP4的TYR194、bLF的GLY313与CKAP4的GLU190,每个结合位点均通过氢键作用结合。综上所述,本论文成功利用酵母双杂交技术证实牛乳铁蛋白与CKAP4存在相互作用。同时,bLF结合Fe3+时与CKAP4存在相互作用,释放Fe3+时与CKAP4不存在相互作用。并通过生物信息学技术进行同源建模并预测其存在6个可能的关键结合位点,每个结合位点均通过氢键作用结合,进一步预测了bLF与CKAP4相互作用的分子机理。这些结果表明bLF通过直接与成骨细胞膜表面的CKAP4结合从而发挥其生物学功能,为牛乳铁蛋白调控成骨细胞活性的相关分子机制研究奠定了基础。