二倍体芽殖酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)在完全没有氮源或处于非发酵型碳源(如醋酸盐)的条件下,会进入减数分裂期和产孢期并最终产生四个单倍体孢子细胞。与营养细胞壁相比,酵母孢子壁的形成起源和结构组成都有很大区别。营养细胞壁是由母细胞壁延伸闭合而成,其结构组成从内到外分别是葡聚糖层和甘露糖层;而酵母孢子壁是在减数分裂完成后的母细胞细胞质中重新合成,其结构组成从内到外依次为甘露糖层、葡聚糖层、壳聚糖层和二酪氨酸层。其中,壳聚糖层和二酪氨酸层是孢子壁特有的组成,并赋予孢子较强的抗胁迫能力。尽管研究表明葡聚糖层中的β-1,6-葡聚糖在营养细胞壁中起着交联键的重要作用,但其合成机理还不清楚,其在酵母孢子壁中的功能及其对孢子壁的影响也尚无报道。此外,据推测,产孢特异性表达基因OSW2可能与孢子壁形成有关,但其具体功能也不清楚。因动物细胞没有细胞壁,所以,真菌细胞壁已成为研发筛选抗真菌药物的靶点。鉴于酵母孢子细胞中几乎所有的基因都可以在营养细胞中找到对应的保守同源基因。因此,对酵母孢子壁中的β-1,6-葡聚糖相关基因和孢子壁形成有关基因OSW2进行深入研究,有助于理解真菌细胞壁的合成机制,为筛选抗真菌药物提供理论基础。此外,由于酵母孢子有较强的抗逆性而且可利用基因工程技术改变孢子壁的通透性,因此,酵母孢子可作为酶固定化载体加以研发应用。本论文以具有高产孢效率的SK1酵母作为出发菌株,根据基因同源重组原理构建了一系列β-1,6-葡聚糖合成缺陷菌株,在没有外层孢子壁(壳聚糖层和二酪氨酸层)的chs3Δ菌株基础上敲除OSW2,构建了osw2Δchs3Δ双缺陷菌株,然后对这些突变体孢子产生的表型缺陷进行研究,并利用突变体孢子进行了酶固定化研究。本论文主要研究结果如下:(1)通过敲除与β-1,6-葡聚糖合成有关基因,证明了β-1,6-葡聚糖是孢子壁完整组合所必需的成分。首先构建了β-1,6-葡聚糖合成缺陷菌株kre1Δ,kre6Δ,kre9Δ与big1Δ并培养产孢。显微镜观察发现突变体孢子和野生型孢子形态表型几乎没有差别。乙醚敏感性实验发现,除了kre6Δ之外,其它所有突变体孢子都表现出乙醚敏感性。壳聚糖Eosin Y染色表明,β-1,6-葡聚糖缺失会导致壳聚糖上调。在β-1,6-葡聚糖突变体基础上敲除壳聚糖合成基因CHS3后,big1Δchs3Δ双缺陷突变体表现出最严重的孢子壁缺陷。大部分的big1Δchs3Δ突变体细胞在高温下都不能形成可见孢子而且产孢细胞活力下降。GPI锚定蛋白GFP-Cwp2定位分析结果表明,β-1,6-葡聚糖缺失会导致GFP-Cwp2无法锚定在孢子壁上。这一现象与营养细胞壁中β-1,6-葡聚糖的功能类似,说明孢子壁中的β-1,6-葡聚糖也起着交联固定GPI-锚定细胞壁蛋白的重要作用。因此,β-1,6-葡聚糖是孢子壁完整组合所必需的成分。(2)通过构建osw2Δchs3Δ双缺陷菌株,发现Osw2是孢子壁内层葡聚糖层和(或)甘露糖层正确组装所必需的。在没有壳聚糖层和二酪氨酸层的chs3Δ基础上敲除OSW2后,显微镜观察发现,osw2Δchs3Δ双缺陷突变体表现出明显的产孢缺陷。GPI锚定蛋白GFP-Cwp2定位分析结果表明,敲除OSW2会导致GFP-Cwp2在osw2Δchs3Δ孢子中的定位错误。当osw2Δ与big1Δ相结合时,big1Δosw2Δ表现出严重的产孢缺陷。定位分析表明,Osw2在产孢过程中定位于前孢子膜,而在成熟孢子中则消失不见,说明Osw2不是孢子壁的结构成分。鉴于Osw2含有2-脱氢泛解酸2-还原酶类似结构域,因此,它可能介导酶活反应。同源比较分析表明,Osw2与含有2-脱氢泛解酸2-还原酶结构域的Pam1、Svl3蛋白有微弱同源性且pam1Δsvl3Δ存在营养细胞壁和孢子壁缺陷,而pam1Δsvl3Δosw2Δ孢子表现出比osw2Δ孢子更严重的乙醚敏感性。因此,综合结果表明,Osw2参与孢子壁内层(葡聚糖和甘露糖层)的正确组装且含有2-脱氢泛解酸2-还原酶结构域的基因可能在葡聚糖层和(或)甘露糖层组装中具有相似功能。(3)发现kre1Δ孢子是综合性能较好的酶固定化载体。将kre1Δ孢子固定的肌酐酶与其它突变体孢子固定的肌酐酶进行比较,结果表明,kre1Δ孢子固定的肌酐酶活性与osw2Δ孢子相近,都显著高于野生型孢子。与游离酶相比,kre1Δ与osw2Δ孢子固定的肌酐酶一样,都有较好的可重复利用性和较强的抗逆性,且两者都表现出较好的耐高温性及较广范围的pH耐受性。因此,kre1Δ与osw2Δ孢子一样,都是综合性能较好的酶固定化载体。