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褪黑素是一种主要由松果体分泌的神经内分泌激素,可调节下丘脑-垂体-睾丸轴活动,进而调节类固醇激素合成,影响雄性动物繁殖性能。睾丸间质细胞是睾丸中类固醇激素合成的主要场所,对大鼠、小鼠和绵羊等哺乳动物的研究,已表明褪黑素可直接作用于睾丸间质细胞影响睾酮合成。本研究通过体外培养鸡睾丸间质细胞,施予不同浓度褪黑素处理36 h,ELISA法检测睾酮分泌量,荧光定量PCR和Western blot检测类固醇激素合成酶(StAR、CyP11a1和3β-HSD)表达;通过干扰褪黑素受体表达,探究褪黑素受体在睾酮合成中的作用;最后通过激活或抑制cAMP/PKA/CREB信号通路,明确该通路是否参与褪黑素抑制鸡睾丸间质细胞睾酮合成。研究结果如下:1、选取21周龄白羽肉种公鸡,采集睾丸提取睾丸间质细胞,并通过3β-HSD特异性染色进行鉴定。待细胞生长状况稳定后,添加不同浓度(0、0.1、1、10、100μg/mL)褪黑素处理36 h,用ELISA法检测睾酮分泌量,荧光定量PCR及Western blot技术检测StAR、CyP11a1和3β-HSD表达量。结果表明,1、10和100μg/mL褪黑素均可显著抑制睾酮合成(P<0.05),其中1μg/mL褪黑素抑制作用最强(P<0.01);荧光定量PCR及Western blot结果也有相同发现,褪黑素可显著抑制StAR、CyP11a1和3β-HSD mRNA及蛋白表达(P<0.01)。2、为明确MEL-1A和MEL-1C是否参与褪黑素对睾酮合成的抑制作用,利用RNAi技术敲减MEL-1A和MEL-1C在鸡睾丸间质细胞表达,试验分为CTR、NC、siRNA、MT和MT+siRNA组,干扰载体转染到鸡睾丸间质细胞24 h后,添加1μg/mL褪黑素处理36 h;采用MEL-1B特异性受体拮抗剂(4-P-PDOT)明确MEL-1B的作用,试验分为CTR、MT及MT+4-P-PDOT(1、5、10μM)组;拮抗剂预处理30 min后,用褪黑素处理36 h。用荧光定量PCR和Western blot技术验证干扰效率,ELISA法检测睾酮分泌量。结果表明,与褪黑素单独处理组相比,MEL-1A敲减及MEL-1B拮抗均可减弱褪黑素对睾酮的抑制效果(P<0.05),受体MEL-1C敲减后并不影响褪黑素对睾酮的抑制作用,提示褪黑素通过膜受体MEL-1A和MEL-1B抑制鸡睾丸间质细胞睾酮合成,而MEL-1C不参与其中。3、用1μg/mL褪黑素处理细胞0、10、20和30 min,ELISA法检测cAMP含量。结果表明,褪黑素处理10 min可显著抑制cAMP含量(P<0.05)。用1μg/mL褪黑素处理细胞0、15、30和45 min,Western blot技术检测CREB磷酸化水平。结果表明,褪黑素处理30 min可显著抑制CREB磷酸化水平(P<0.05)。用cAMP/PKA/CREB信号通路抑制剂预处理细胞后,再加入褪黑素处理30 min。结果显示,cAMP抑制剂与褪黑素共处理后,可减弱褪黑素对CREB磷酸化的抑制效果(P<0.05),PKA抑制剂与褪黑素共处理也有相同效果。延长褪黑素处理至36 h,用ELISA法检测睾酮分泌量。结果表明,cAMP抑制剂与褪黑素共处理后,可减弱褪黑素对睾酮的抑制效果(P<0.05)。荧光定量PCR结果显示,cAMP和PKA抑制剂预处理均减弱褪黑素对StAR,CyP11a1和3β-HSD mRNA表达的抑制作用(P<0.05),用cAMP激活剂或PKA激活剂预处理或CREB过表达再用褪黑素处理,结果表明cAMP、PKA激活剂和CREB过表达均可减弱褪黑素对CREB磷酸化水平和睾酮分泌水平的抑制作用(P<0.05),并伴随着褪黑素对StAR,CyP11a1和3β-HSD mRNA表达抑制作用的减弱(P<0.05)。综上:褪黑素可显著抑制鸡睾丸间质细胞睾酮分泌及其关键合成酶表达,其中1μg/mL褪黑素抑制效果最强,褪黑素通过膜受体MEL-1A和MEL-1B抑制睾酮合成,cAMP/PKA/CREB信号通路参与这一过程。