【摘 要】
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γ-谷氨酰肽在动植物食品和发酵食品中广泛分布,因具有浓厚味感和丰富的生理活性而受到广泛关注。γ-谷氨酰肽亦可通过酶法合成,该方法具有简单快速、安全无毒、无需分离纯化即可应用于食品中的优点,是一种可用于工业化合成γ-谷氨酰肽的绿色技术。尽管有学者已建立了多种γ-谷氨酰肽的酶促合成方法,并且探索了部分γ-谷氨酰肽的特性,但大量功能性的γ-谷氨酰肽仍需进一步开发。本课题旨在以谷氨酰胺（Gln）和精氨酸（
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γ-谷氨酰肽在动植物食品和发酵食品中广泛分布,因具有浓厚味感和丰富的生理活性而受到广泛关注。γ-谷氨酰肽亦可通过酶法合成,该方法具有简单快速、安全无毒、无需分离纯化即可应用于食品中的优点,是一种可用于工业化合成γ-谷氨酰肽的绿色技术。尽管有学者已建立了多种γ-谷氨酰肽的酶促合成方法,并且探索了部分γ-谷氨酰肽的特性,但大量功能性的γ-谷氨酰肽仍需进一步开发。本课题旨在以谷氨酰胺（Gln）和精氨酸（Arg）为底物,通过酶法合成一种新型的具有浓厚味感和咸味增强作用的γ-谷氨酰肽,γ-[Glu]（n≥1）-Arg,并初步探索γ-[Glu]（n=1,2）-Arg在抑制脂肪细胞增殖和分化方面的功能特性,具体研究结果如下:（1）通过乙醇沉淀制备得到了一种谷氨酰胺酶聚集体,当乙醇的添加比例为50%（v/v）时,该聚集体的水解活力和转肽活力分别为初始谷氨酰胺酶的91.27%和292.34%;处理前后谷氨酰胺酶的最适温度均为45°C,且均能在碱性条件（p H 9-11）下发挥最大催化活力,但处理后的谷氨酰胺酶聚集体对温度的耐受性下降;此外,乙醇处理能使谷氨酰胺酶聚集体获得显著增加的粒径和与处理前无显著差异的Zeta电位和PDI,并使谷氨酰胺酶蛋白的α-螺旋升高,反平行β-折叠降低。（2）确定了可使用解淀粉芽孢杆菌源谷氨酰胺酶在37°C、初始p H 10、0.2%加酶量的条件下合成γ-[Glu]（n≥1）-Arg,并且探索了不同固形物浓度（5%-40%）对该酶促合成反应的影响。研究证明,高固形物浓度不仅可加速反应进行,还能使得酶促产物中γ-[Glu]（n≥1）-Arg的含量增加;当Gln与Arg的摩尔比为2:1时,反应产物中仅检测到γ-[Glu]（n≥1）-Arg,而未检测到副产物γ-[Glu]（n≥1）-Gln。（3）建立了通过UPLC-MS/MS和HPLC定性定量检测γ-[Glu]（n=1,2,3,4）-Arg的方法,并根据这些方法对酶促合成的产物进行了检测。研究证明,γ-[Glu]（n=1）-Arg和γ-[Glu]（n=2）-Arg在30%固形物浓度时含量最高,分别为16.61%和10.50%;而γ-[Glu]（n=3）-Arg和γ-[Glu]（n=4）-Arg在20%固形物浓度时含量最高,分别为9.95%和5.92%;总体而言,在30%固形物浓度下,γ-[Glu]（n=1,2,3,4）-Arg四种γ-谷氨酰肽的含量总和最高,达42.19%。（4）研究了γ-[Glu]（n≥1）-Arg的厚味增强和咸味增强特性,并测定了γ-[Glu]（n≥1）-Arg对基本呈味物质、模拟肉汤和Na Cl溶液的味觉增强效果。研究证明,酶促反应混合物和γ-[Glu]（n=1,2,3,4）-Arg标准品均在水溶液中仅呈现较淡的涩苦味,但添加到基本呈味物质后可令原有味觉效果增强,其中鲜味增强最为明显,咸味次之,甜味最少;30%固形物浓度合成的酶促产物对基本呈味物质的增强效果最为明显,在添加量20 mg/m L时,该产物还能令模拟肉汤的厚味和咸味分别增加2倍和1.7倍,并且令Na Cl溶液的咸味增加1.5倍。（5）以3T3-L1前脂肪细胞为模型,初步探索了Arg、γ-Glu-Arg和γ-Glu-Glu-Arg对其增殖和分化的影响。研究证明,以上三种样品不仅可对3T3-L1前脂肪细胞的增殖起到抑制作用,还能减少3T3-L1前脂肪细胞分化过程中的脂滴积累和甘油三酯蓄积,并同时增强甘油释放;在此过程中,Arg、γ-Glu-Arg或γ-Glu-Glu-Arg至少参与了一种与3T3-L1前脂肪细胞分化相关基因的m RNA的表达调控。
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