TSPO/VDAC1介导的线粒体自噬在糖尿病视网膜病变中的作用机制研究

来源 :南昌大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:Heat05041094
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目的:糖尿病视网膜病变(Diabetic Retinopathy,DR)是糖尿病最为常见的微血管并发症之一,属于视网膜退行性疾病,严重导致患者视力障碍及失明。研究证实其病理过程与线粒体自噬密切相关。基于此,本研究从线粒体自噬这一重要的细胞内适应性事件出发,进一步探究其在糖尿病视网膜病变中的作用机理及调控机制。转位蛋白(TSPO)与电压阴离子通道蛋白1(VDAC1)同为线粒体渗透性转运孔组成成分,两种蛋白相互作用有助于提高线粒体质量控制效率,调节线粒体结构和功能,并且其表达比例对于细胞稳态至关重要。TSPO和VDAC1组成蛋白复合物,当TSPO/VDAC1比例增大时,减少线粒体偶联并促进活性氧(ROS)的过量产生,从而抑制PINK1/Parkin途径下游的线粒体自噬,限制SQSTM1/p62的线粒体募集,取消自噬标记物LC3Ⅱ的线粒体重排,导致功能障碍的线粒体积聚。综上,本研究旨在以STZ诱导的糖尿病性视网膜病变大鼠为模型,探究TSPO/VDAC1在DR发病中的作用,并进一步体外实验探讨TSPO/VDAC1是否可能通过线粒体自噬途径对DR发挥调控作用,阐明TSPO/VDAC1在DR中的作用机制。方法:1.采用STZ构建DR动物模型,大鼠分为两组,正常对照组和DR模型组,HE染色观察大鼠视网膜病理损伤情况,ELISA试剂盒检测血清炎症因子IL-lβ,IL-18水平,Western Blot检测VDAC1蛋白、线粒体自噬关键分子PINK1、Parkin、LC3Ⅱ、SQSTM1/P62 的表达,免疫组化、Western Blot 检测 TSPO 蛋白的表达。2.体外模拟DR进程,将原代HRCECs在高糖(30mM)下分别培养Oh、3h、12h、24h、48h,实时荧光定量 PCR 检测 TSPO、VDAC1、TXNIP、DNM1L、PINK1、Parkin、P62/SQSTM1、LC3Ⅱ的 mRNA 水平,Western Blot 检测 TSPO、VDAC1、PINK1、Parkin、SQSTM1/P62、LC3Ⅱ 蛋白的表达,CCK8 检测各组细胞活性和增殖能力,Annexin V/PI流式细胞术检测各组细胞凋亡情况,线粒体ROS检测试剂盒检测线粒体ROS水平,ELISA试剂盒检测细胞上清液IL-1β,IL-18水平。3.在原代HRCECs中用慢病毒转染TSPO,细胞分为shNC组(慢病毒空载体组+高糖处理48h),shTSPO组(TSPO沉默慢病毒载体组+高糖处理48h),Western Blot 检测 TSPO、VDAC1、PINK1、Parkin、SQSTM1/P62、LC3Ⅱ 蛋白的表达,CCK8检测两组细胞活性和增殖能力,Annexin V/PI流式细胞术检测两组细胞凋亡情况。shNC组(慢病毒空载体组+高糖处理48h),sh-TSPO组(TSPO沉默慢病毒载体组+高糖处理48h),shNC+3-MA组(慢病毒空载体组+高糖处理48h+3-甲基腺嘌呤),shTSPO+3-MA组(TSPO沉默慢病毒载体+高糖处理48h+3-甲基腺嘌呤组),Western Blot 检测 TSPO、VDAC1、PINK1、Parkin、SQSTM1/P62蛋白的表达,Annexin V/PI流式细胞术检测各组细胞凋亡情况。结果:1.DR大鼠视网膜中线粒体自噬相关蛋白表达降低,线粒体自噬活性受到抑制;TSPO蛋白表达升高,VDAC1蛋白表达降低,TSPO/VDAC1比值增大;DR大鼠视网膜炎症反应升高。2.原代HRCECs高糖处理后,细胞活力和增殖能力下降,凋亡率升高,胞内ROS、TXNIP mRNA水平升高,炎症因子IL-1β,IL-18表达上升,线粒体裂解蛋白DNM1L mRNA水平升高,线粒体自噬关键蛋白PINK1、Parkin表达下降P62/SQSTM1蛋白表达下降,TSPO蛋白表达升高,VDAC1蛋白表达降低,TSPO/VDAC1比值增大。3.高糖下在原代HRCECs中用慢病毒沉默TSPO后,TSPO蛋白表达下降,VDAC1蛋白表达提高,TSPO/VDAC1比值缩小,线粒体自噬关键蛋白PINK1、Parkin表达水平显著上升,自噬底物P62/SQSTM1表达上调,细胞活性提高,细胞凋亡率,炎症因子水平均较空载体组下降。高糖环境下在稳定低表达TSPO的原代HRCECs中加入自噬抑制剂3-MA后,发现3-MA抑制剂能够抑制沉默TSPO后导致的自噬活性升高;同样ELISA结果显示抑制自噬水平后炎性因子IL-1β、IL-18表达升高;流式凋亡实验结果显示抑制自噬水平后细胞凋亡比例增加。结论:1.高糖环境可导致体内和体外TSPO表达升高,VDAC1表达下降,TSPO/VDAC1比值增大,线粒体自噬受到抑制;ROS生成过多,炎症因子分泌增加以及细胞凋亡。2.高糖下在原代HRCECs内下调TSPO表达,会使VDAC1表达上调,TSPO/VDAC1比值降低。3.TSPO/VDAC1在高糖下促进ROS生成,抑制线粒体自噬PINK1/Parkin通路,并且通过抑制线粒体自噬促进炎症因子分泌以及细胞凋亡,从而参与DR的发生发展。
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