生猪肉中金黄色葡萄球菌的检测及耐药机制研究

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抗生素的滥用导致耐药性细菌的出现并泛滥,细菌的耐药性及其耐药基因可通过食物链从动物传播给人类,这对人类的健康造成直接威胁。本研究从广州市六家超市及三家农贸市场中采集110份生猪肉样品,根据国标GB4789.10—2010对样品进行金黄色葡萄球的分离及鉴定,采用纸片扩散法(K-B)进行抗生素敏感实验,用多位点序列分型(MLST)进行分子分型,采用PCR法验证MRSA并筛选检测第一类整合子及相关耐药基因盒,并探讨第一类整合子整合酶(IntI1)介导的耐药基因盒在不同菌种间的水平转移的研究。具体内容如下:首先按照随机采样法采集生猪肉样品110份,其中生鲜瘦肉50份,排骨29份,内脏类31份,按照国标法分离鉴定金黄色葡萄球菌,共有34份样品检出被金黄色葡萄球菌,每份阳性样品保存一株菌株,共得到34株金黄色葡萄球菌。其中50份生鲜瘦肉中检出16份,检出率为32%,29份排骨样品检出率最高为34.5%,内脏类样品检出率为25.8%,各类样品间检出率没有显著性差异。35份采自农贸市场的生猪肉样品检出10株金黄色葡萄球菌,检出率为28.6%,75份采自超市的猪肉样品中金黄色葡萄球菌的检出率为32.0%(n=24)。对分离得到的34株菌株进行采用CLSI2012推荐的纸片扩散法抗生素敏感实验,耐药率由高到低依次为:青霉素100%、四环素88.2%、甲氧苄胺嘧啶76.5%、红霉素64.7%、克林霉素61.8%、利福平44.1%、头孢西丁38.3%、米诺环素35.3%、氯霉素17.6%、庆大霉素17.6%、诺氟沙星14.7%、呋喃妥因8.8%。MRSA检出率为38.3%(13/34),PCR验证mecA基因,对比药敏实验结果,符合率为76.9%(10/13)。本次实验共获得26种耐药表型谱,其中34株金黄色葡萄球菌对2种抗生素耐药的为5.9%(2/34),对3种抗生素耐药的为5.9%(2/34),对4种抗生素耐药的为11.8%(4/34),对5种抗生素耐药的为23.5%(8/34),多重耐药率高达52.9%(18/34),多重耐药菌株以对β-内酰胺类、大环内酯类和四环素类均耐药为主,占66.7%。为了解不同菌株间是否同源,确定其相关性,对所有34株金黄色葡萄球菌进行多位点序列分型,所有34株菌共分成7个序列分型,分别为ST6(1/34)、ST7(16/34)、ST9(9/34)、ST59(1/34)、ST239(4/34)、ST2259(2/34),并获得一株等位基因谱为5-4-1-4-4-6-53的新型ST。本实验发现广州市售猪肉序列型以ST7为主,占47.1%,ST9次之,占26.5%,MRSA序列型发现有两种分别为ST9(6/10)和ST239(4/10)。对第一类整合子整合酶基因PCR结果显示,34株菌中有5株菌PCR阳性,即第一类整合酶阳性率为14.7%。对整合酶阳性的菌株进行第一类整合子可变区扩增,结果显示有2株菌含携带大小不一的可变区序列,分别为frA17-aadA5,EstX基因盒。对含frA17-aadA5的菌株提取质粒,研究第一类整合酶介导的耐药基因盒在不同菌种间的水平转移:转化及自然转移,均取的了成功,提示第一整合子可以在不同菌间传播。综上所述,实验显示生猪肉中金黄色葡萄球菌污染比较严重,且具有严重的抗生素耐药现象,ST7为主要的序列型号,第一类整合子存在于食源性金黄色葡萄球菌中,相关基因盒对菌株耐药发挥作用,且I类整合子可以在不同菌间传播。
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