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D-苯基乳酸（D-PLA）是一种广谱抗菌化合物,具有抗细菌和真菌的活性,同时D-苯基乳酸比L-苯基乳酸抗菌活性更高,在食品行业展现出良好的应用前景。此外,D-苯基乳酸也可以用作饲料添加剂、化妆品活性成分和医药中间体。目前D-苯基乳酸的化学合成法工艺复杂、环境污染严重、产物光学纯度低。生物法中的发酵法和酶法面临产物浓度低、成本高和不能工业化的难题。采用全细胞催化法有望降低D-苯基乳酸的生产成本,提高催化效率,使D-苯基乳酸更具应用价值。D-乳酸脱氢酶消耗辅酶NADH,催化苯丙酮酸生成D-苯基乳酸,但是辅酶NADH的消耗增加了生产成本。本课题首先构建了D-乳酸脱氢酶和甘油脱氢酶氧化还原自平衡辅酶再生体系,D-乳酸脱氢酶消耗辅酶NADH催化苯丙酮酸生成D-苯基乳酸和辅酶NAD+,甘油脱氢酶则消耗辅酶NAD+催化甘油生成二羟基丙酮和NADH,使反应持续进行生产D-苯基乳酸,降低生产成本。D-乳酸脱氢酶和甘油脱氢酶共表达菌株CP001全细胞催化1 g/L苯丙酮酸生成D-苯基乳酸0.49 g/L,得率为0.49 g/g。其次,通过构建D-乳酸脱氢酶和甘油脱氢酶双功能融合蛋白,实现辅酶的原位再生,提高氧化还原自平衡体系辅酶利用效率,使反应持续进行提高D-苯基乳酸的产量。采用Over-lap PCR技术构建了4种柔性Linker长度为（GGGGS）1、（GGGGS）2、（GGGGS）3、（GGGGS）6的D-乳酸脱氢酶和甘油脱氢酶融合蛋白基因,并导入大肠杆菌得到融合蛋白重组大肠杆菌CP101、CP102、CP103、CP104,4种融合蛋白重组工程菌催化合成D-苯基乳酸产量分别为0.54 g/L,0.59g/L,0.64 g/L,0.52 g/L。为了进一步提高4种融合蛋白重组大肠杆菌全细胞催化合成D-苯基乳酸的产量,对全细胞催化合成D-苯基乳酸工艺条件进行了优化,最佳诱导条件:诱导剂浓度0.2 mmol/L,25 oC诱导表达10 h;最佳反应条件:反应温度37 oC、反应pH7.0,底物苯丙酮酸10 g/L,底物:细胞催化剂=1:1。工艺优化后,4种重组大肠杆菌催化合成D-苯基乳酸的产量分别提高到了4.67 g/L、4.98 g/L、5.37 g/L、4.43g/L。在最优诱导和转化条件下,对重组大肠杆菌催化合成D-苯基乳酸的能力进行比较,发现含有4种柔性Linker的融合蛋白菌株CP101、CP102、CP103和CP104在合成D-苯基乳酸能力上是单基因表达菌株CP001的1.16-1.41倍,其中Linker长度为（GGGGS）3的融合蛋白菌株CP103催化合成D-苯基乳酸产量最高,为5.37g/L,得率为0.54 g/g。