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P24是一种重要的核衣壳相关蛋白,其基因p24在杆状病毒生活史中所发挥的作用以及在细胞中的功能少有人研究,本实验选取Bm NPV为载体对该基因进行深入研究。本实验首先扩增出含有Bmp24基因同源臂的打靶片段,利用Red重组技术实现了打靶片段与目的基因之间的替换,进而成功构建了Bmp24缺失型病毒并命名为Bmp24-ko-Bacmid;然后构建重组转移载体p Fast Bac HTB-p24,利用Bac-to-Bac系统将该Bmp24定点补回到缺失型Bacmid的多角体启动子下游,成功构建了Bmp24补回型Bacmid并命名为Bmp24-re-Bacmid。为了研究Bmp24在细胞中的调控功能,实验将缺失型病毒(Bmp24-ko-Bacmid)、补回型病毒(Bmp24-re-Bacmid)以及野生型病毒(wt Bacmid)等量转染到正常的家蚕卵巢细胞(Bm N)当中。病毒滴度测定结果显示3种病毒的转染都能够引起细胞发病,即都可以产生有感染力的子代病毒。通过滴度值得比较,发现Bmp24缺失型病毒的滴度值显著低于野生型和补回型病毒(P<0.05)。为了进一步了解Bmp24对病毒颗粒包装的影响,收集感染48h后的细胞进行透射电镜分析,电镜结果显示Bmp24缺失型病毒感染的细胞中只有少量细长的杆状结构,但在野生型病毒感染的细胞当中出现大量包装成熟的病毒颗粒。透射电镜显示缺失Bmp24仍然可以包装子代病毒,但对包装为成熟的病毒粒子有显著影响,与滴度测定结果一致。为了研究Bmp24的缺失对病毒基因组复制的影响,实验选取了ODV的囊膜蛋白结构基因Bmgp41为代表基因,进行q PCR分析。实验结果显示随着3种病毒基因组转染时间的延长,Bmgp41的拷贝数均增加,但各时相Bmgp41的拷贝数无显著差异。为了研究Bmp24的缺失对病毒基因组转录水平的影响,实验选取了Bm NPV中非常具有代表性的3个基因进行RT-q PCR,分别是病毒早期基因Bmlef-3、晚期基因Bmvp39和极晚期基因Bmp10。RT-q PCR实验结果显示,相对于野生型病毒,Bmp24的缺失会显著降低子代病毒基因组中Bmlef-3、Bmvp39和Bmp10的转录水平(P<0.05),但Bmp24的补回可以弥补这一现象。综上所述可知,Bmp24基因的缺失对子代病毒基因组的复制水平没有显著影响,即是病毒复制的非必需基因;缺失Bmp24基因的Bacmid仍然可以产生有感染力的BV粒子,说明Bmp24基因不是BV形成的必需基因;但Bmp24的缺失会降低子代病毒的感染力,说明Bmp24对BV的感染力有一定影响。RT-q PCR结果说明Bmp24基因缺失会降低病毒基因组早期、晚期以及极晚期基因的转录水平,即Bmp24的缺失对病毒基因转录水平有一定影响。为了进一步研究该基因的性质,本实验将目的基因Bmp24克隆到原核表达载体p ET-28a(+)上,在大肠杆菌BL-21(star)中诱导表达带有6×His标签的融合蛋白,大小约为24.8KDa,与预期一致。通过Ni柱纯化获得Bm P24并进行BCA定量,通过免疫新西兰雄兔制备多克隆抗体。ELISA实验检测多克隆抗体的效价为128,00U,Western-Blot鉴定Bm P24基因在Bm NPV中是一个晚期表达基因。