梨轮纹病是我国梨主产区的重要病害,可危害枝干、叶片和果实,造成枝叶枯死和果实腐烂,严重威胁我国梨产业的发展。目前已报到的病原菌有多种葡萄座腔菌,但其致病机理研究尚缺乏。本研究从我国不同梨产区采集表现轮纹病典型症状的枝干组织,进行病原菌分离和鉴定分析,明确其优势病原种;依据该病原菌侵染寄主后的症状表现选取其编码的木质素过氧化物酶基因（LiP）作为研究对象,通过基因敲除、互补和超表达分析LiP的生物学功能,为解析梨轮纹病病原菌的分子致病机制提供新的试验依据,取得的结果如下:1.我国梨轮纹病病原葡萄座腔菌（Botryosphaeria）的种类鉴定。从我国16个省、直辖市（安徽、北京、重庆、福建、河北、河南、湖北、江苏、江西、辽宁、四川、山东、陕西、山西、云南和浙江）的梨主产区,采集呈现轮纹病典型症状的枝干样品共232份,其中轮纹样品124份、干腐样品108份。采用组织法分离、纯化共获得341个葡萄座腔菌（Botryosphaeria）菌株,其中174个菌株分离于表现轮纹症状的样品,167个菌株分离于表现干腐症状的样品。形态学观察结合SSU、ITS及EF1-a序列系统进化分析的结果显示,在所获得的菌株中,302个属于B.kuwatsukai,从表现为轮纹或干腐症状的枝干样品中均可分离得到,在我国的南北方栽培梨上均有分布;39个属于B.dothidea,仅从表现为干腐症状的枝干样品中分离出,主要分布在我国的北方梨产区。分别选取B.kuwatsukai和B.dothidea各12个代表菌株,在一年生梨枝干上进行活体接种和离体接种试验,结果显示,B.kuwatsukai对梨枝干的致病力明显强于B.dothidea,可产生轮纹和干腐,而B.dothidea仅引起干腐。结果表明,B.kuwatsukai为我国梨主产区轮纹病的优势病原种,可引起两种症状类型。2.B.kuwatsukai木质素过氧化物酶基因序列分析及生物学功能研究。木质素过氧化物酶是木质素生物降解过程中主要的木质素降解酶类,目前已从白腐真菌中发现。本研究通过生物信息学方法,从B.kuwatsukai强致病力菌株SZ2l62中筛选到7个编码LiP蛋白的基因（Botryosphaeria kuwatsukai Lignin Peroxidase,BkLiP）。基因序列分析结果显示,BkLiP1基因全长为1116 bp,无内含子区域,该基因编码371 aa,N端含有一个21 aa的信号肽结构,无跨膜结构域;BkLiP2基因全长为1048 bp,包含两个内含子,可编码的CDs长度为939 bp,该基因编码的蛋白含有312 aa,N端含有一个19 aa的信号肽结构,无跨膜结构域。同源蛋白遗传进化树分析结果显示,BkLiP1-BkLiP4为有信号肽的过氧化物酶蛋白,在子囊菌中非常保守;而BkLiP5-BkLiP7为不含有信号肽的过氧化物酶蛋白。通过RT-q PCR检测分析,发现B.kuwatsukai的BkLiP1和BkLiP2基因在其侵染的梨组织中呈上调表达。分泌性试验结果显示BkLiP1蛋白的信号肽具有分泌功能。对BkLiP1进行敲除、回补和超表达的结果看出,基因敲除突变体及信号肽缺失突变体的菌丝生长速率减慢,分生孢子产量以及菌丝干重均未受到影响,对梨的致病力减弱。该基因回补和超表达转化子的致病力分别与野生型一致和明显增强。BkLiP1的6个半胱氨酸位点突变转化子的致病力测定结果显示,仅c BkLiP1C92A转化子致病力较野生型弱。上述结果表明,B.kuwatsukai在对梨的致病中其BkLiP1基因发挥重要作用。本氏烟叶片的亚细胞定位观察发现,该蛋白定位于寄主细胞的质外体空间。瞬时表达结果看出,BkLiP1可引起本氏烟叶片过敏性坏死、活性氧爆发、胼胝体积累以及免疫相关通路基因的上调表达,结果表明B.kuwatsukai分泌的BkLiP1还具有MAMP功能,触发寄主产生免疫反应。本研究首次证实B.kuwatsukai可引起轮纹和干腐两种症状类型,为我国梨产区轮纹病的优势病原种。研究发现该病菌的木质素过氧化物酶基因（BkLiP1）在其对梨的致病中具有重要作用,BkLiP1蛋白还可激发本氏烟的免疫反应。研究结果为解析B.kuwatsukai的分子致病机制提供了新的试验依据,对梨产区轮纹病防控也具重要意义。