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第一部分:M i rt2参与LPS介导的巨噬细胞极化过程及炎症反应目的:Toll样受体4是一种在固有免疫中扮演重要地位的模式识别受体,它广泛分布于巨噬细胞表面,在巨噬细胞极化过程中扮演重要作用。长链非编码RNA涉及各种生理病理活动,目前有关长链非编码RNA在巨噬细胞极化过程中的作用的研究较为欠缺,本实验旨在探索参与巨噬细胞极化过程的长链非编码RNA。方法:使用LPS诱导腹腔巨噬细胞向M1型转化,通过lncRNA-microarray技术分析M1型巨噬细胞和静息状态巨噬细胞之间lncRNA的表达谱,挑选出其中表达水平出现的差异的lncRNA-Mirt2。通过LPS和IL-4分别诱导巨噬细胞向M1和M2极化,检测Mirt2的表达水平变化,使用荧光原位杂交技术确定Mirt2在巨噬细胞中的亚细胞定位。通过腹腔注射LPS的方法建立小鼠内毒素血症模型,通过实时定量PCR技术和荧光杂交技术检测各个组织中Mirt2的表达水平变化。结果:巨噬细胞经LPS诱导后,其内有98个lncRNA上调幅度大于20倍,下调的有47个,其中上调幅度最大且在巨噬细胞中高表达的lncRNA是Mirt2。巨噬细胞在LPS刺激时Mirt2上调,而在IL-4刺激时下调。Mirt2主要定位于巨噬细胞细胞质中,且在巨噬细胞含量高的组织高表达,各个组织在LPS诱导的内毒素血症时Mirt2上调,且在组织中Mirt2定位于组织巨噬细胞细胞质中而罕见于组织实质细胞。结论:巨噬细胞在LPS刺激下有大量长链非编码RNA表达量出现变化。Mirt2富集于巨噬细胞细胞质中,且在巨噬细胞受到LPS刺激向M1型极化时表达量增加。在体组织中的Mirt2也随着LPS刺激而表达量上升,主要原因是因为组织中组织巨噬细胞内Mirt2上调所致。IL-4介导的巨噬细胞向M2型细胞极化时Mirt2表达量下降。第二部分:M i rt2通过影响TRAF6的寡聚化和泛素化调控其功能目的:既往研究提示LPS介导的巨噬细胞极化过程和炎症反应中Mirt2表达量增高,为明确Mirt2在这一过程中的地位和分子机制,我们针对探索Mirt2的互作蛋而白进行了进一步研究。方法:结合RNA-pull down和质谱分析技术找寻巨噬细胞中能与Mirt2结合的蛋白,通过候选蛋白和LPS相关信号通路的相关性分析挑选出其中可能的Mirt2相互作用的蛋白TRAF6。通过免疫共沉淀和RNA结合蛋白免疫沉淀技术确定Mirt2与该蛋白结合。通过免疫荧光染色确定两者在空间上是否共定位。通过构造截短的突变TRAF6蛋白以及Mirt2找寻两者可能相互作用的区域。通过构建搭载Mirt2的重组腺病毒主动上调细胞中Mirt2的表达水平,结合免疫共沉淀和免疫印迹技术探索TRAF6的寡聚化和泛素化水平与外源性Mirt2过表达之间的关系,以及TRAF6下游信号通路和细胞内Mirt2表达水平之间的关系。结果:巨噬细胞细胞质中的Mirt2能与TRAF6蛋白结合。TRAF6的环指结构域和锌指模体两者任何一个的缺失都将导致TRAF6失去结合Mirt2的能力,Mirt2能抑制TRAF6的寡聚化和K63相关泛素化水平。Mirt2能抑制TRAF6泛素化从而降低TRAF6下游的p65和jnk的磷酸化。结论:Mirt2通过与TRAF6的环指结构域、锌指模体相互作用而与之结合。Mirt2能抑制巨噬细胞TRAF6的寡聚化和泛素化水平从而调控其下游信号通路。第三部分:Mirt2调节巨噬细胞的极化且能抑制炎症反应目的:既然Mirt2调节了巨噬细胞极化相关的信号通路,那么Mirt2是否在细胞水平参与了巨噬细胞的极化过程,在宏观的活体层面影响了 LPS相关的炎症反应。在这一部分我们将对此进行探索。方法:使用搭载Mirt2转录本的重组腺病毒过表达目标细胞内Mirt2水平,使用搭载能表达干扰Mirt2表达的shRNA序列的重组腺病毒敲低目标细胞中Mirt2的水平。在过表达和敲低巨噬细胞中Mirt2后,予以LPS刺激,使用实时定量PCR检测其中M1巨噬细胞表型相关蛋白:TNF,IL-1β,IL-6,IL-12的表达水平,利用免疫印迹技术检测相关信号通路jnk,erk1/2,p38和p65的磷酸化水平。小鼠尾静脉注射搭载Mirt2的腺病毒,在小鼠体内过表达Mirt2,然后腹腔注射LPS构造内毒素血症模型。检测生存率、血浆炎症因子水平、病理切片以及组织炎症相关信号通路p65和jnk磷酸化程度来评估小鼠炎症程度。检测动脉粥样硬化、急性心梗、肥胖症、STZ诱导的Ⅰ型糖尿病,四氯化碳诱导的急性肝损伤、蛋氨酸胆碱缺乏饮食诱导的非酒精性肝病等模型的病灶组织Mirt2相对于健康小鼠的表达水平,探究Mirt2和其他炎性相关性疾病的关系。结果:过表达Mirt2能抑制巨噬细胞的经典活化通路,抑制M1巨噬细胞分泌相关促炎因子。Mirt2能抑制LPS诱导的MAPK和NF-κB信号通路的激活。小鼠体内外源性过表的Mirt2能降低内毒素血症相关的死亡率和血浆内炎症因子的浓度。在小鼠体内过表达外源的Mirt2能抑制内毒素血症所引起的肺、肝损伤,抑制器官内炎症反应和炎症相关通路的激活。在动脉粥样硬化、急性心梗、肥胖症和STZ诱导的Ⅰ型糖尿病等动物模型中Mirt2表达水平增高,且Mirt2富集于病灶的M1型巨噬细胞中,而在四氯化碳诱导的急性肝损伤、蛋氨酸胆碱缺乏饮食诱导的非酒精性肝病等模型中Mirt2表达水平相较正常小鼠无明显差别。结论:Mirt2能抑制巨噬细胞向M1型细胞极化的经典活化通路。Mirt2能抑制巨噬细胞极化过程中的MAPK和NF-κB信号通路激活。Mirt2可以缓解小鼠体内LPS引起的内毒素血症所致的靶器官损害。Mirt2与部分炎性相关性疾病有一定程度的联系。