蛋白质是细胞及机体生物功能的主要承担者,包括复制基因组信息、调节转录、传递信号、提供结构、催化反应和运输分子。蛋白质几乎参与到机体生命活动的各个方面,并在人类的新陈代谢、生长发育和机体衰老过程中发挥重要作用。研究表明,当机体发生严重病变甚至癌变时,发挥相应功能的某些蛋白质表现出明显的表达或功能异常。因而,发展一系列能够超灵敏分析检测与肿瘤等重大疾病密切相关的蛋白质方法,对临床疾病的早期诊断、针对性治疗、药物研发筛选以及相应的分子机制研究方面大有裨益。研究发现,具有相应诊断和治疗意义的蛋白质在细胞内通常是痕量存在的,同时生物体内其它活性蛋白质对目标蛋白的检测存在干扰,因此这些蛋白质的分析检测方法要求必须具有很高的灵敏度和很好的特异性。目前,常规的蛋白质检测方法包括质谱法（Mass Spectrometry）、蛋白免疫印迹法（western blot,WB）、酶联免疫吸附法（Enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA）、荧光法（Fluorescence Assay）和电化学法（Electrochemical Assay）等。其中,荧光分析法以特异性强、灵敏度高和操作简单等优势得到了众多研究者的青睐。近年来,以信号扩增技术为基础构建的蛋白质高灵敏检测方法为生物样本中的蛋白质分析提供了有利手段。基于此,本研究着眼于利用信号放大技术,选择表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor,EGFR）、Argonaute 2（Ago2）、组蛋白脱乙酰酶（histone deacetylase,HDAC）/蛋白酪氨酸磷酸酶1 B（protein tyrosine phosphatase 1B,PTP1B）以及黏蛋白1（mucin 1,MUC1）为分析模型,构建了一系列新型的荧光分析生物传感器,实现蛋白质的超灵敏检测。具体的研究内容如下:1、构建一种基于目标蛋白EGFR诱导的双SDA与T7核酸外切酶辅助的信号循环放大检测荧光方法。该方法涉及两个阶段的链置换扩增（strand displacement amplification,SDA）与T7核酸外切酶（T7 exonuclease,T7 exo）辅助的酶促扩增。当目标蛋白EGFR存在时,第一个链置换扩增反应（SDA 1）在KF聚合酶和Nt.BbvCI核酸内切酶的辅助下被启动。随着SDA 1反应的进行可以启动第二个链置换扩增反应（SDA 2）,两个链置换扩增反应累计生成大量报告寡核苷酸（report probe）。同时被不断循环利用的EGFR可以循环启动SDA1和SDA2,源源不断的生成reporter probe。因此,在T7核酸外切酶作用下,大量的双链DNA Taqman probe-reporter probe不断地杂交-消化,从而产生强烈的荧光信号。该方法的检测下限低至0.16 fM,同时可以实际应用于肺癌细胞内源性EGFR的灵敏检测,实现癌2、发展了一种基于双信号放大的DNAzyme荧光生物传感器超灵敏检测Ago2。首先设计了一条可以和Ago2识别结合的指导RNA（guide RNA,gRNA）,二者结合形成的RNA诱导沉默复合体（RNA-induced silencing complexes,RSIC）,具有识别并切割底物sRNA的活性。在Ago2存在时,可以诱导底物sRNA发生切割并产生游离的RCA引物,从而触发RCA反应以生成大量的8-17 DNAzyme,最终这些8-17 DNAzyme可以循环切割信号探针达到增强荧光信号的目的。该方法的检测限为0.35 pM。此外,该方法可用于测定Ago2抑制剂,同时可以准确测定HeLa细胞提取物的内源Ago2活性,检出限为3个HeLa细胞,在Ago2相关的基础研究和临床应用中具有巨大的应用潜力。3、设计了一种基于肽模板化-纳米金（AuNPs）结构介导的荧光生物传感器,用于同时检测多种翻译后修饰（Posttranslational modification,PTM）酶活性。分别设计了多肽1FITC/biotin和多肽2 Cy5/biotin修饰的肽链,多肽1序列中赖氨酸被乙酰化修饰,多肽2序列中丝氨酸被磷酸化修饰。多肽底物通过链霉亲和素和生物素的特异性结合,能够快速自组装到AuNPs的表面。HDAC的存在可以去除多肽1中赖氨酸ε-氨基上的乙酰基,随后可被胞内蛋白酶rLys-C裂解（它特异性裂解赖氨酸残基的C端,但不能识别乙酰化的赖氨酸残基）,导致FITC标记的多肽片段从纳米传感器上解离,从而恢复FITC荧光。类似地,PTP1B的存在可促进多肽2中酪氨酸残基磷酸基的去除,随后可被蛋白酶CPY水解（它可特异性消化多肽底物C端的肽键）,导致Cy5标记的多肽片段从纳米传感器上释放,从而恢复了Cy5荧光。因此,增强的FITC和Cy5荧光可分别用于HDAC和PTP1B的准确定量。该方法灵敏度高,HDAC的检测限为28 pm,PTP1B的检测限为0.8 pM,可用于筛选PTM酶抑制剂和检测癌细胞提取物中的PTM酶。4、研发一种基于发夹锁定DNAzyme探针的纳米金（AuNPs）传感器用于细胞中蛋白质MUC1的荧光信号放大检测。该方法构建基于AuNPs的DNA马达用于检测蛋白质,DNA马达由Mg²⁺依赖的DNAzyme,AuNPs和DNAzyme底物3部分组成。AuNPs作为支架构成DNAzyme的三维轨道,AuNPs表面DNAzyme的高密度结合增强了DNAzyme底物在三维轨道的移动。当加入靶蛋白质MUC1并和适配体结合后,激活DNA马达系统。再加入Mg²⁺,发生切割反应,荧光基团释放,根据荧光强度的变化来检测蛋白质含量的高低。同时DNAzyme底物分离并与另一个DNAzyme杂交结合,不断循环可以实现信号放大。此方法实现了DNAzyme底物沿AuNPs的自主移动及对MUC1的超灵敏检测。该方法的检测限可达0.36 fg/mL,并在血清样品中展现良好的回收效率。