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倍半萜烯类化合物(sesquiterpene)及其衍生物广泛分布于自然界中,是植物精油的重要组分之一,很多倍半萜化合物具有明显的生物活性和应用价值。圆柚酮((+)-nootkatone),属于倍半萜化合物瓦伦西亚烯的酮类衍生物,具有独特的芳香气味,作为重要的香料原料在食品、日用品、化妆品以及烟草等等行业中有着广泛的应用,具有很高的市场价值。
圆柚酮在天然精柚中的含量很低,再加上其立体异构体以及众多萜烯类化合物的存在,一般很难直接分离获得,圆柚酮的天然提取路线不具有商业价值。目前,工业上常通过化学氧化价格相对便宜的瓦伦西亚烯((+)-valencene)来获得圆柚酮,但在这过程中往往使用一些具毒性或污染性的氧化剂,对环境造成严重的危害。近十几年来,采用生物技术催化瓦伦西亚烯生成圆柚酮已成为这一领域研究的新方向,特别是利用细胞色素P450BM-3(cytochrome P450BM-3,CYP450BM-3)对瓦伦西亚烯进行氧化,已成为获得圆柚酮的一条潜在途径。
来源于巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)的CYP450BM-3是CYP450家族当中特殊的一员,因其亚铁血红素结构域和负责电子转移的FAD/FMN还原结构域都包含在同一条肽链中,因此该酶在进行催化时无需CYP450还原酶的辅助作用,这个独特的性质使它具备了开发成为工业用P450酶的潜力。以定点突变、易错PCR和体外同源重组技术(DNA shuffling)等等为代表的定向进化技术已被用于对CYP450BM-3进行改造,以期获得对非天然底物具有良好催化活性的突变体。本文基于已有文献报道,旨在寻找对瓦伦西亚烯具有更高催化效率和产物选择性的CYP450BM-3突变体。
本研究利用定点突变技术,对野生型CYP450BM-3基因进行改造,获得了R47L/Y51F/F87A和A74G/F87V/L188Q两个突变体。将野生型和突变体基因分别连接入pET28a(+)中进行重组表达,利用纯化的重组酶在体外对底物瓦伦西亚烯进行催化。气相色谱被用来检测各酶的催化产物,并分析、比较各突变酶与野生型CYP450BM-3对瓦伦西亚烯的催化活性。
在体外,野生型CYP450BM-3-底物复合物对NADPH的催化速率为31±1.0 nmol(nmol P450)-1min-1,但产物中没有检测到圆柚酮生成;突变体R47L/Y51F/F87A对应的这一氧化速率要高于前者,为79±6.5 nmol(nmol P450)-1min-1,并在其催化产物中检测到圆柚酮的生成,但圆柚酮含量仅占总产物的6.8％；与此同时,A74G/F87V/L188Q表现出与后者相当的催化效率(77±7.2 nmol(nmol P450)-1min-1),但产物中圆柚酮的含量更高,达8.0％。
A74G/F87V/L188Q是本课题成功获得的一个新的可以催化瓦伦西亚烯生成圆柚酮的CYP450BM-3突变体,表现出迄今为止最好的产物选择性,同时兼具有较高的催化效率,但还未达到工业用酶的要求。在接下来的研究中,我们会设计和试验更多的突变体,以便能取得更大的进步。