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目的:在本课题组前期试验发现与正常人相比,腹泻型肠易激综合征患者结肠粘膜中有72miRNA表达异常,通过对它们的靶基因进行分析,发现它们与细胞膜转运、离子通道调控等过程相关。本研究通过miRDB,即mi RNA靶基因及生物信息数据库(http://www.mirdb.org/miRDB/)对以上72个miRNAs进行生物学分析,筛选出同时在人体及大鼠中表达,且与细胞膜受体兴奋、跨膜转运、神经/肌肉兴奋相关,即可能与类胰蛋白酶/PAR2调控通道相关的miRNAs。通过对比分析,选取其一作为目标miRNA,进一步研究其与IBS-D大鼠相关症状及类胰蛋白酶/PAR2调控通道的相关性,并通过构建携带沉默目标miRNA基因的慢病毒载体转染IBS-D大鼠模型进一步证实目标miRNA与类胰蛋白酶/PAR2调控通道间的相互作用。方法:1.在miRDB数据库的生物学分析中,我们发现只有miR29b-1-5p、miR490-5p符合筛选标准。用乙酸灌肠加束缚应激的方法,利用健康Wistar大鼠构建IBS-D大鼠模型,分正常组(8只)和造模(8只),采用大鼠腹壁撤离反射(AWR)、大鼠粪便性状、胃肠通过时间评估IBS-D是否成功模型。在IBS-D大鼠模型的结肠组织中用qTR-PCR检测筛选出的2个miRNA表达情况,通过综合分析选miRAN490-5p作为目标miRNA。2.32只健康Wistar大鼠随机分为4组,分别为正常组、IBS-D组、空载体组、miR490-5p沉默组,每组各8只。正常组无特殊处理,后3组采用同前方法构建IBS-D大鼠模型,用同前方法评估大鼠模型是否构建成功。同时,构建携带沉默miR490-5p基因的慢病毒载体及慢病毒空载体(由上海瑞赛公司构建),分别通过尾静脉注射入miR490-5p沉默组、空载体组大鼠体内,1次/隔日,共注射3次,正常组及IBS-D组大鼠以同样方法注射相同剂量的0.9%生理盐水。完成注射72h后检测所有大鼠最小AWR阈值所需的注射量、大鼠粪便性状、胃肠通过时间。次日处死所有大鼠,取结肠组织,HE染色评估结肠粘膜组织炎症情况,q RT-PCR检测结肠组织中的miR490-5p表达情况;qRT-PCR、Western blot检测结肠组织中类胰蛋白酶、PAR2表达情况。结果:1.结合前期试验结果及miRDB数据库分析结果,mi R490-5p、miR29b-1-5p符合筛选标准。2.与正常组对比,造模组大便湿重、大便含水量及大便数量显著增加,腹部收缩反射最小阈值所需注射的生理盐水量明显降低,肠道传输时间明显缩短,上述指标差异具有统计学意义(p<0.05),提示大鼠IBS-D模型制作成功。3.HE染色结果显示:正常组和造模组大鼠的结肠组织炎症Kruschewski评分为0-1分,未见明显炎症。4.与正常组大鼠相比,IBS-D大鼠结肠组织中miR-490-5p表达明显上调,差异有统计学意义(P<0.05),与本课题组前期的人体试验结果相同;而miR29b-1-5p表达显著下调,差异具有统计学意义(P<0.05),与前期人体试验结果不符合。因此选miR490-5P作为目标miRNA。5.与IBS-D组大鼠相比,尾静脉注射携带沉默miR490-5p基因的慢病毒载体后,大鼠结肠组织miR490-5p表达显著降低,差异具有统计学意义(P<0.05),提示目标miRNA沉默成功;大鼠WAR最小阈值的所需注射量显著增加,大鼠大便湿重、大便含水量及大便数量显著减少,胃肠通过时间显著延长,差异均有统计学意义(P<0.05),提示沉默miR490-5p后IBS-D大鼠的相关症状有所改善;注射慢病毒空载体后,大鼠结肠组织miR490-5p表达无显著变化,差异无统计学意义(P>0.05),提示慢病毒空载体对miR490-5p表达无影响;大鼠WAR最小阈值的注射量、大便湿重、大便含水量、大便数量、胃肠通过时间无显著变化,差异均无统计学意义(P>0.05)。6.HE染色结果:四组大鼠的结肠组织炎症Kruschewski评分均为0-1分,未见明显炎症。7.完慢病毒成注射72h后,与IBS-D组大鼠相比,沉默组大鼠结肠组织的类胰蛋白酶及PAR2表达显著下降,差异有统计学意义(P<0.05);空载体组大鼠结肠组织的类胰蛋白酶及PAR2表达无无明显变化,差异无统计学意义(P>0.05)。与空载体组相比,沉默组大鼠结肠组织miR490-5p表达、类胰蛋白酶及PAR2表达显著下降,差异有统计学意义(P<0.05)。结论:1.mi R490-5p可调节IBS-D大鼠的结肠敏感性、肠道通道时间及肠道渗透性,表明miR490-5p参与IBS-D发病。2.mi R490-5p可调节IBS-D大鼠结肠组织的类胰蛋白酶、PAR2表达,表明miR490-5p可能与类胰蛋白酶/PAR2调控通道相关。3.mi R490-5p可能通过调节类胰蛋白酶/PAR2调控通道影响IBS-D相关症状。