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背景
胆汁淤积性疾病是多种疾病的集合，从单基因儿科疾病和胆道闭锁到受环境因素强烈影响的成人多基因表型，如原发性硬化性胆管炎(primary sclerosing cholangitis，PSC)和原发性胆管炎(primary biliary cholangitis，PBC)。PSC和PBC是慢性、进行性炎症性疾病，PSC的特点是大、小胆管均发生纤维性改变，而PBC仅影响小胆管。PSC患者以男性居多，而PBC患者以女性居多。PSC是肠-肝轴的典型疾病，常被认为是炎症性肠病(inflammatory bowel disease，IBD)的肠外表现。肝脏具有调节代谢、内分泌及免疫应答等功能，分泌的胆汁入肠道后通过肝-肠循环作用于肠道。由于解剖结构和血管系统的特点，肠道与肝脏存在密切的联系，肝脏疾病的发生发展与肠道的关系逐渐受到关注。人们认为人体内微生物群落的构成随着时间的推移是相对稳定的。一方面，微生物群受益于肠道丰富的营养环境，为建立相对稳定的生态系统铺平了道路。另一方面，肠道微生物群丰富了宿主自身所不具备的重要的生理功能。肠道菌群还具有实质性的粘膜屏障功能，影响粘膜免疫系统的发展，也是生理代谢过程进一步发展所必需的。许多临床和实验报告支持脂肪酸代谢和肠道微生物群之间的关系。肠道微生物群产生多种多样的化合物在调节的活动远端器官中发挥重要作用。因为微生物群成份及其新陈代谢的高复杂性，肠道肝脏轴的概念必须辅以肠-微生物-肝的网络结构。胆汁酸通过EHC介导肝脏和肠道之间的相互沟通。胆汁酸不仅对脂肪膳食和维生素的吸收很重要，它们也是核受体法尼酯X受体(farnesoid X receptor， FXR)和G蛋白偶联胆汁酸受体-1(Gprotein-coupledbileacidreceptor1，GP-BAR1，也称为TGR5)的配体。由于进入小肠的胆盐浓度降低，肠道菌群失调发生，致病性、促炎性微生物成员包括紫单胞菌科和肠杆菌科过度生长，并通过细胞壁成分LPS和微生物移位引起炎症反应，炎症抑制肝脏合成胆汁酸，形成恶性循环。人体通过FXR-小异二聚体伴侣(small heterodimer partner, SHP)和FXR-成纤维细胞生长因子15/19(fibroblast growth factor 15/19，FGF15/19)途径可以调节CYP7A1的表达,影响胆汁酸代谢。血红素氧合酶-1(Heme Oxygenase-1， HO-1)是人类和哺乳动物组织中广泛存在的一种加氧酶，是催化血红素的起始酶和限速酶。HO-1及其催化产物如：一氧化碳(Carbon Monoxide，CO)及胆红素等物质，经研究发现在体内具有抗炎、抗氧化、调控细胞凋亡等重要作用。有研究发现HO-1可以通过促进巨噬细胞的杀菌活性抑制小鼠肠道炎症，维持肠道稳态。课题组已有研究表明，HO-1可通过调控NF-κB、P38MAPKs、PI3K/Akt等多个信号通路，抑制炎性因子释放并减少细胞凋亡等，保护细胞免受损伤。
目的
我们在之前的预实验研究中发现，肝硬化患者伴随着被认为是良性及原位定植的相对丰富的细菌类群减少，包括毛螺旋菌科(Lachnospiraceae)和疣微菌科(Ruminococcaceae)。而其他菌群，尤其是肠杆菌科和类杆菌相对丰度增加。我们将在目前研究的基础上，对于胆汁淤积早期，是否已经存在肠道菌群紊乱与胆汁酸代谢异常，以及二者出现的改变是否存在一定的相关性进行进一步研究，并构建胆汁淤积及肠道吸附胆汁酸动物模型验证猜想。同时，我们将探索HO-1是否能干预肠道菌群的改变并通过影响胆汁酸代谢调节肠道FXR-SHP通路，减少胆汁酸回流，增加胆汁酸排除。为今后抑制肝损伤进一步恶化的药物研究提供实验数据支持。
方法
(1)采用横断面调查研究的方法在大连医科大学附属第一医院和大连市第六人民医院进行调查。共10位急性乙型肝炎伴黄疸患者和18位健康志愿者参与此次研究，均于晨空服采血留便用于检测。应用液相色谱串联质谱法(liquid chromatography tandem mass spectrometry, LC-MS/MS)检测粪便胆汁酸构成，包括：胆酸(Cholic acid，CA)、鹅去氧胆酸(Chenodeoxycholate，CDCA)、去氧胆酸(Deoxycholate，DCA)、熊去氧胆酸(Ursodeoxycholic acid，UDCA)、石胆酸(Lithocholic acid ， LCA )、牛磺胆酸(Taurocholic acid hydrate ， TCA )、牛磺熊去氧胆酸(Tauroursodeoxycholate，TUDCA)、牛磺鹅去氧胆酸(Taurochenodeoxycholate，TCDCA)、牛磺去氧胆酸(Taurodeoxycholate hydrate，TDCA)、牛磺石胆酸(Taurolithocholate， TLCA)、甘氨胆酸(Glycocholic acid hydrate，GCA)、甘氨鹅去氧胆酸(Glycochenodeoxycholic acid，GCDCA)、甘氨去氧胆酸(Glycochenodeoxycholic acid，GDCA)。应用16s焦磷酸测序方法检测粪便菌群，比较两组粪便胆汁酸及菌群构成的差异，同时探索粪便胆汁酸与菌群之间的关联。(2)构建胆汁淤积动物模型，采用改进的胆总管结扎(BDL)大鼠模型，验证BDL模型可以用于模拟胆汁淤积性肝损害，并给予大鼠服用考来烯胺，进一步研究粪便胆汁酸与粪便菌群的关联。进行内源性及外源性HO-1的干预，同时给予BDL模型大鼠双歧杆菌灌胃培养，探索HO-1/CO对粪便胆汁酸及粪便胆汁酸的影响，并研究HO-1/CO与FXR-SHP通路的关联。
结果
(1)患者组较健康组血清肝功学检查中ALT、AST、T-BIL、D-BIL、γ-GT、ALP、TBA、CHE、Crea升高，GLU、TP、Glob下降。
(2)患者组粪便胆汁酸较健康组CA、UDCA、CDCA、DCA、LCA、TUDCA均降低。(3)患者组粪便菌群在属(Genus )水平上，Escherichia-Shigella、Prevotella_9、Pseudobutyrivibrio、Faecalibacterium、Klebsiella、Lachnoclostridium较健康组降低，Streptococcus、Blautia、Raoultella、Enterococcus、Others患者组较健康组升高。
(4)在Genus水平上，健康组中Faecalibacterium与GCDCA呈正相关。Streptococcus与GCA呈负相关。Escherichia_Shigella与LCA、CDCA、TDCA呈正相关，与TCA呈负相关。Raoultella与LCA、CDCA呈正相关，与GCA、TCA呈负相关。Klebsiella与TLCA呈正相关，与CA、DCA呈负相关(见表7A、7B)。患者组中Escherichia_Shigella与GCDCA、TCDCA呈负相关。Blautia与GDCA呈正相关。Pseudobutyrivibrio与TUDCA呈正相关。
(5)BDL组ALT、AST、AKP、γ-GT及TBA均高于Sham组，考来烯胺组TBA较Sham组减少。HE染色证实BDL建模后，出现肝损害，但未达到肝硬化程度。
(6)BDL组CDCA较Sham组减少，考来烯胺组较Sham组TCA、TUDCA、TCDCA、TDCA及TLCA升高。
(7)在属水平TOP30物种相对丰度柱状图，大鼠以Lactobacillus、Romboutsia、Clostridium_sensu_stricto_1、Allobaculum等菌群为主，BDL组和考来烯胺组菌群多样性较Sham组减少。BDL组较Sham组Lactobacillus、Clostridium_sensu_stricto_1、Xylanophilum_group及Enterococcus增高，unidentified_Bacteroidales_S24-7_group、Lachnoclostridium、Parasutterella及Staphylococcus减少。考来烯胺组较Sham组Lactobacillus、Turicibacter、Lachnospiraceae_NK4A136_group及Gemella增高，Allobaculum、Ruminococcaceae_UCG-014、Ruminococcus_1及unidentified_Bacteroidales_S24-7_group减少。
(8)Sham组Lachnospiraceae_NK4A136_group与CA呈正相关，与UDCA呈负相关。Clostridium_sensu_stricto_1、Turicibacter及Ruminococcus_1与TLCA呈正相关。Prevotellaceae_Ga6A1_group与TDCA呈负相关。Faecalibaculum与GCA、GDCA呈正相关Prevotella_9与TDCA呈负相关。BDL组Bifidobacterium与LCA、GDCA及DCA呈正相关。Prevotellaceae_Ga6A1_group与CDCA和TCA呈负相关。Lachnospiraceae_NK4A136_group与GCDCA呈正相关。Faecalibaculum与TLCA呈正相关。Ruminococcus_1和Faecalibacterium与CDCA呈负相关。考来烯胺组Bifidobacterium与CA、DCA、TCA、TCDCA及GCA呈正相关。Clostridium_sensu_stricto_1与TCDCA、TLCA及GCA呈正相关。Faecalibaculum与TCDCA和GCA呈正相关。Faecalibacterium与GCA呈负相关。
(9)比较BDL组和菌群灌胃组发现内毒素、DAO及D-Lac均显著下降。
(10)CoPP组13种粪便胆汁酸较BDL组，TCA、TUDCA和TDCA含量增加。菌群灌胃组13种粪便胆汁酸较BDL组，UDCA、TUDCA和LCA含量增加。
(11)Sham组、BDL组、CoPP组及ZnPP组四组进行比较，Sham组以拟杆菌属及普雷沃氏菌属为优势差异菌，BDL组以梭菌属为优势差异菌，而CoPP和ZnPP优势差异菌与前两者相似。Sham组、BDL组、CORM-2组及iCORM-2组四组进行比较，CORM-2组以乳酸菌属为优势差异菌，iCORM-2组以毛螺菌属和肠杆菌属为优势差异菌。Sham组、BDL组及菌群灌胃组三组进行比较发现，菌群灌胃组以颗粒丙酸杆菌属为优势差异菌。
(12)CoPP、CORM-2及菌群灌胃干预后，三组FXR的相对表达量较BDL组均明显增加，但仅CoPP组SHP的相对表达量较BDL组明显增加。
(13)HO-1过表达及敲除细胞株FXR及SHP的表达，HO-1过表达组中FXR和SHP的相对表达量高于其对应的空载组，而HO-1敲低组中FXR和SHP的相对表达量与其对应的空载组未见明显差异。
结论
(1)我们研究了急性乙型肝炎伴有黄疸患者在疾病早期，肠内胆汁酸与菌群的变化，并分析探讨了二者存在的关联。揭示了在胆汁淤积性肝病早期就存在肠道菌群紊乱及胆汁酸代谢异常。
(2)我们成功构建了模拟胆汁淤积性肝损害动物模型，并进一步探索了粪便胆汁酸与粪便菌群的关联。尤其是发现了双歧杆菌属不光在抗炎方面有着突出的表现，它在调节肠内胆汁酸代谢方面也起到了不可或缺的重要作用。
(3)双歧杆菌不但具有抑菌抗炎的作用，能提高紧密连接蛋白的表达，进一步修复了肠屏障的损坏。HO-1不仅可以通过抗炎等途径保护肠屏障，它还可以通过合理的调节肠道菌群的紊乱，纠正肠道内的胆汁酸代谢，直接及间接激活FXR-SHP通路修复肠屏障延缓疾病恶化。
胆汁淤积性疾病是多种疾病的集合，从单基因儿科疾病和胆道闭锁到受环境因素强烈影响的成人多基因表型，如原发性硬化性胆管炎(primary sclerosing cholangitis，PSC)和原发性胆管炎(primary biliary cholangitis，PBC)。PSC和PBC是慢性、进行性炎症性疾病，PSC的特点是大、小胆管均发生纤维性改变，而PBC仅影响小胆管。PSC患者以男性居多，而PBC患者以女性居多。PSC是肠-肝轴的典型疾病，常被认为是炎症性肠病(inflammatory bowel disease，IBD)的肠外表现。肝脏具有调节代谢、内分泌及免疫应答等功能，分泌的胆汁入肠道后通过肝-肠循环作用于肠道。由于解剖结构和血管系统的特点，肠道与肝脏存在密切的联系，肝脏疾病的发生发展与肠道的关系逐渐受到关注。人们认为人体内微生物群落的构成随着时间的推移是相对稳定的。一方面，微生物群受益于肠道丰富的营养环境，为建立相对稳定的生态系统铺平了道路。另一方面，肠道微生物群丰富了宿主自身所不具备的重要的生理功能。肠道菌群还具有实质性的粘膜屏障功能，影响粘膜免疫系统的发展，也是生理代谢过程进一步发展所必需的。许多临床和实验报告支持脂肪酸代谢和肠道微生物群之间的关系。肠道微生物群产生多种多样的化合物在调节的活动远端器官中发挥重要作用。因为微生物群成份及其新陈代谢的高复杂性，肠道肝脏轴的概念必须辅以肠-微生物-肝的网络结构。胆汁酸通过EHC介导肝脏和肠道之间的相互沟通。胆汁酸不仅对脂肪膳食和维生素的吸收很重要，它们也是核受体法尼酯X受体(farnesoid X receptor， FXR)和G蛋白偶联胆汁酸受体-1(Gprotein-coupledbileacidreceptor1，GP-BAR1，也称为TGR5)的配体。由于进入小肠的胆盐浓度降低，肠道菌群失调发生，致病性、促炎性微生物成员包括紫单胞菌科和肠杆菌科过度生长，并通过细胞壁成分LPS和微生物移位引起炎症反应，炎症抑制肝脏合成胆汁酸，形成恶性循环。人体通过FXR-小异二聚体伴侣(small heterodimer partner, SHP)和FXR-成纤维细胞生长因子15/19(fibroblast growth factor 15/19，FGF15/19)途径可以调节CYP7A1的表达,影响胆汁酸代谢。血红素氧合酶-1(Heme Oxygenase-1， HO-1)是人类和哺乳动物组织中广泛存在的一种加氧酶，是催化血红素的起始酶和限速酶。HO-1及其催化产物如：一氧化碳(Carbon Monoxide，CO)及胆红素等物质，经研究发现在体内具有抗炎、抗氧化、调控细胞凋亡等重要作用。有研究发现HO-1可以通过促进巨噬细胞的杀菌活性抑制小鼠肠道炎症，维持肠道稳态。课题组已有研究表明，HO-1可通过调控NF-κB、P38MAPKs、PI3K/Akt等多个信号通路，抑制炎性因子释放并减少细胞凋亡等，保护细胞免受损伤。
目的
我们在之前的预实验研究中发现，肝硬化患者伴随着被认为是良性及原位定植的相对丰富的细菌类群减少，包括毛螺旋菌科(Lachnospiraceae)和疣微菌科(Ruminococcaceae)。而其他菌群，尤其是肠杆菌科和类杆菌相对丰度增加。我们将在目前研究的基础上，对于胆汁淤积早期，是否已经存在肠道菌群紊乱与胆汁酸代谢异常，以及二者出现的改变是否存在一定的相关性进行进一步研究，并构建胆汁淤积及肠道吸附胆汁酸动物模型验证猜想。同时，我们将探索HO-1是否能干预肠道菌群的改变并通过影响胆汁酸代谢调节肠道FXR-SHP通路，减少胆汁酸回流，增加胆汁酸排除。为今后抑制肝损伤进一步恶化的药物研究提供实验数据支持。
方法
(1)采用横断面调查研究的方法在大连医科大学附属第一医院和大连市第六人民医院进行调查。共10位急性乙型肝炎伴黄疸患者和18位健康志愿者参与此次研究，均于晨空服采血留便用于检测。应用液相色谱串联质谱法(liquid chromatography tandem mass spectrometry, LC-MS/MS)检测粪便胆汁酸构成，包括：胆酸(Cholic acid，CA)、鹅去氧胆酸(Chenodeoxycholate，CDCA)、去氧胆酸(Deoxycholate，DCA)、熊去氧胆酸(Ursodeoxycholic acid，UDCA)、石胆酸(Lithocholic acid ， LCA )、牛磺胆酸(Taurocholic acid hydrate ， TCA )、牛磺熊去氧胆酸(Tauroursodeoxycholate，TUDCA)、牛磺鹅去氧胆酸(Taurochenodeoxycholate，TCDCA)、牛磺去氧胆酸(Taurodeoxycholate hydrate，TDCA)、牛磺石胆酸(Taurolithocholate， TLCA)、甘氨胆酸(Glycocholic acid hydrate，GCA)、甘氨鹅去氧胆酸(Glycochenodeoxycholic acid，GCDCA)、甘氨去氧胆酸(Glycochenodeoxycholic acid，GDCA)。应用16s焦磷酸测序方法检测粪便菌群，比较两组粪便胆汁酸及菌群构成的差异，同时探索粪便胆汁酸与菌群之间的关联。(2)构建胆汁淤积动物模型，采用改进的胆总管结扎(BDL)大鼠模型，验证BDL模型可以用于模拟胆汁淤积性肝损害，并给予大鼠服用考来烯胺，进一步研究粪便胆汁酸与粪便菌群的关联。进行内源性及外源性HO-1的干预，同时给予BDL模型大鼠双歧杆菌灌胃培养，探索HO-1/CO对粪便胆汁酸及粪便胆汁酸的影响，并研究HO-1/CO与FXR-SHP通路的关联。
结果
(1)患者组较健康组血清肝功学检查中ALT、AST、T-BIL、D-BIL、γ-GT、ALP、TBA、CHE、Crea升高，GLU、TP、Glob下降。
(2)患者组粪便胆汁酸较健康组CA、UDCA、CDCA、DCA、LCA、TUDCA均降低。(3)患者组粪便菌群在属(Genus )水平上，Escherichia-Shigella、Prevotella_9、Pseudobutyrivibrio、Faecalibacterium、Klebsiella、Lachnoclostridium较健康组降低，Streptococcus、Blautia、Raoultella、Enterococcus、Others患者组较健康组升高。
(4)在Genus水平上，健康组中Faecalibacterium与GCDCA呈正相关。Streptococcus与GCA呈负相关。Escherichia_Shigella与LCA、CDCA、TDCA呈正相关，与TCA呈负相关。Raoultella与LCA、CDCA呈正相关，与GCA、TCA呈负相关。Klebsiella与TLCA呈正相关，与CA、DCA呈负相关(见表7A、7B)。患者组中Escherichia_Shigella与GCDCA、TCDCA呈负相关。Blautia与GDCA呈正相关。Pseudobutyrivibrio与TUDCA呈正相关。
(5)BDL组ALT、AST、AKP、γ-GT及TBA均高于Sham组，考来烯胺组TBA较Sham组减少。HE染色证实BDL建模后，出现肝损害，但未达到肝硬化程度。
(6)BDL组CDCA较Sham组减少，考来烯胺组较Sham组TCA、TUDCA、TCDCA、TDCA及TLCA升高。
(7)在属水平TOP30物种相对丰度柱状图，大鼠以Lactobacillus、Romboutsia、Clostridium_sensu_stricto_1、Allobaculum等菌群为主，BDL组和考来烯胺组菌群多样性较Sham组减少。BDL组较Sham组Lactobacillus、Clostridium_sensu_stricto_1、Xylanophilum_group及Enterococcus增高，unidentified_Bacteroidales_S24-7_group、Lachnoclostridium、Parasutterella及Staphylococcus减少。考来烯胺组较Sham组Lactobacillus、Turicibacter、Lachnospiraceae_NK4A136_group及Gemella增高，Allobaculum、Ruminococcaceae_UCG-014、Ruminococcus_1及unidentified_Bacteroidales_S24-7_group减少。
(8)Sham组Lachnospiraceae_NK4A136_group与CA呈正相关，与UDCA呈负相关。Clostridium_sensu_stricto_1、Turicibacter及Ruminococcus_1与TLCA呈正相关。Prevotellaceae_Ga6A1_group与TDCA呈负相关。Faecalibaculum与GCA、GDCA呈正相关Prevotella_9与TDCA呈负相关。BDL组Bifidobacterium与LCA、GDCA及DCA呈正相关。Prevotellaceae_Ga6A1_group与CDCA和TCA呈负相关。Lachnospiraceae_NK4A136_group与GCDCA呈正相关。Faecalibaculum与TLCA呈正相关。Ruminococcus_1和Faecalibacterium与CDCA呈负相关。考来烯胺组Bifidobacterium与CA、DCA、TCA、TCDCA及GCA呈正相关。Clostridium_sensu_stricto_1与TCDCA、TLCA及GCA呈正相关。Faecalibaculum与TCDCA和GCA呈正相关。Faecalibacterium与GCA呈负相关。
(9)比较BDL组和菌群灌胃组发现内毒素、DAO及D-Lac均显著下降。
(10)CoPP组13种粪便胆汁酸较BDL组，TCA、TUDCA和TDCA含量增加。菌群灌胃组13种粪便胆汁酸较BDL组，UDCA、TUDCA和LCA含量增加。
(11)Sham组、BDL组、CoPP组及ZnPP组四组进行比较，Sham组以拟杆菌属及普雷沃氏菌属为优势差异菌，BDL组以梭菌属为优势差异菌，而CoPP和ZnPP优势差异菌与前两者相似。Sham组、BDL组、CORM-2组及iCORM-2组四组进行比较，CORM-2组以乳酸菌属为优势差异菌，iCORM-2组以毛螺菌属和肠杆菌属为优势差异菌。Sham组、BDL组及菌群灌胃组三组进行比较发现，菌群灌胃组以颗粒丙酸杆菌属为优势差异菌。
(12)CoPP、CORM-2及菌群灌胃干预后，三组FXR的相对表达量较BDL组均明显增加，但仅CoPP组SHP的相对表达量较BDL组明显增加。
(13)HO-1过表达及敲除细胞株FXR及SHP的表达，HO-1过表达组中FXR和SHP的相对表达量高于其对应的空载组，而HO-1敲低组中FXR和SHP的相对表达量与其对应的空载组未见明显差异。
结论
(1)我们研究了急性乙型肝炎伴有黄疸患者在疾病早期，肠内胆汁酸与菌群的变化，并分析探讨了二者存在的关联。揭示了在胆汁淤积性肝病早期就存在肠道菌群紊乱及胆汁酸代谢异常。
(2)我们成功构建了模拟胆汁淤积性肝损害动物模型，并进一步探索了粪便胆汁酸与粪便菌群的关联。尤其是发现了双歧杆菌属不光在抗炎方面有着突出的表现，它在调节肠内胆汁酸代谢方面也起到了不可或缺的重要作用。
(3)双歧杆菌不但具有抑菌抗炎的作用，能提高紧密连接蛋白的表达，进一步修复了肠屏障的损坏。HO-1不仅可以通过抗炎等途径保护肠屏障，它还可以通过合理的调节肠道菌群的紊乱，纠正肠道内的胆汁酸代谢，直接及间接激活FXR-SHP通路修复肠屏障延缓疾病恶化。