目的:间充质干细胞是20世纪末发现的一种成体干细胞,经研究发现该种细胞可由多种成体组织中获得。因其具有多向分化潜能及免疫调控等功能,该细胞具有较广阔的临床应用前景。现在,临床研究的间充质干细胞以脐带来源最为常见。自2015年《干细胞制剂质量控制及临床前研究指导原则》下发以来,临床研究的间充质干细胞多采用无血清培养体系进行体外培养。但与之相伴随的问题则是细胞增殖能力偏弱且容易老化。鉴于本实验室以前的研究成果,本文着重研究小分子化合物ABO联合D609在无血清体系中对脐带间充质干细胞的老化是否有抑制作用,并探讨联合作用下脐带间充质干细胞的应用优势。内容:1.从脐带组织中分离获得间充质干细胞(MSCs),并对细胞相关基础指标进行鉴定。2.确定ABO及D609的使用浓度,并验证这两种化合物的使用对脐带间充质干细胞老化的影响。3.研究ABO及D609的使用对脐带间充质干细胞长时间运输抗凋亡能力的影响。4.检测ABO及D609的使用对脐带间充质干细胞核型和细胞表型的影响。方法:1.使用组织块贴壁培养的方法获得脐带间充质干细胞(MSCs),并按照常规方法进行细胞培养。取第三代细胞进行HE染色观察细胞形态并进行体外诱导分化等基本检测。2.用流式细胞仪检测细胞表型。3.将培养的脐带间充质干细胞分为实验组和对照组,取第八代细胞,实验组额外添加ABO及D609,检测细胞增殖情况,并利用半乳糖苷酶染色方法检测细胞老化情况,流式方法检测细胞长时间运输后的凋亡水平。4.验证ABO和D609联合培养是否会对间充质干细胞的核型和细胞表型产生影响。结果:1.使用组织块贴壁法可以从脐带中分离得到间充质干细胞,细胞形态为纺锤状且贴附于培养瓶壁生长。2.间充质干细胞表面标志物CD34、CD45、HLA-DR阴性表达(低于2%),CD44、CD73、CD90、CD105高表达(高于95%),符合间充质干细胞细胞表型特征;间充质干细胞在体外诱导培养条件下可向成骨方向、成指方向及成软骨方向分化。3.与对照组相比,实验组(添加ABO及D609组)的细胞增殖活性更强,且活性减退速度慢,经保存放置后细胞凋亡比率水平更低;同时对第8代细胞进行半乳糖苷酶染色检测后发现,实验组比对照组细胞老化比率低;4.从原代培养开始添加ABO及D609培养脐带间充质干细胞至第八代后细胞表型及核型检测均正常。结论:1.通过直接贴壁法获得的脐带间充质干细胞生物特征符合常规要求。2.在本实验室使用的无血清培养体系中添加ABO及D609后对脐带间充质干细胞的增殖有促进作用,能够抑制细胞老化且细胞在生理盐水中长时间保存的活率更高。3.使用ABO及D609培养脐带间充质干细胞不会对其安全性造成影响。4.使用ABO和D609培养脐带间充质干细胞对于细胞的临床应用前细胞的制备运输均有更好的效果。