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肠道微生物通过SCFAs影响机体的脂肪代谢,但机制并不清楚。本研究通过改变肉鸡肠道微生物菌群,并分析SCFAs的变化,探讨微生物代谢产生的SCFAs在肠道内的信号传递,并初步探讨SCFAs介导的GLP-1对肉鸡脂肪代谢的调控机制。肉鸡FFAR2、FFAR3和GLP-1R组织相对表达规律本研究首先对FFAR2、FFAR3和GLP-1R在肉鸡肠道、肝脏和腹部脂肪组织中的基因表达规律进行了分析。结果表明,在AA肉鸡肠道中,FFAR2和FFAR3的表达由十二指肠、空肠、回肠、盲肠到结直肠依次升高;在肝脏和脂肪组织中也检测到FFAR2和FFAR3的表达,其中在脂肪组织中的表达水平最高。GLP-1R在肠道、肝脏和腹脂中的表达与FFARs基本一致。肠道微生物菌群对SCFAs组成及腹部脂肪沉积的影响采用常规日粮饲喂肉鸡,通过添加益生菌(丁酸梭菌4×105 cfu/g,双歧杆菌2×105cfu/g,植物乳杆菌2×105 cfu/g,粪肠球菌2×105 cfu/g)和抗生素(氨苄青霉素1kg/T,新霉素0.5 kg/T)改变肠道微生物菌群,研究肉鸡肠道微生物对SCFAs的影响,及其与脂肪代谢的关联。结果显示,与对照组相比,益生菌和抗生素二者均可提高盲肠Firmicutes门微生物的丰度,降低Bacteroidetes和Proteobacteria门微生物的丰度。盲肠SCFAs分析结果表明,益生菌可显著提高21d乙酸(p<0.05)和丁酸(p<0.001)的含量,降低丙酸的含量(p<0.01);显著提高21d盲肠丁酸在总SCFAs中比例(p<0.001),降低丙酸的比例(p<0.001)。抗生素组除21d盲肠内乙酸含量具有升高的趋势外,其余时间盲肠SCFAs的含量均低于对照组;抗生素组盲肠丙酸的比率在14d时显著降低(p<0.01),乙酸的比率在14、21和42d均有增加的趋势,丁酸的比率与对照组相比差异不大。生长和屠宰试验结果表明,益生菌可显著降低21d腹脂率(p<0.05),抗生素对21d和42d腹脂率的影响不尽相同。q PCR分析结果显示,益生菌可极显著提高肉鸡结直肠FFAR2(p<0.001)、FFAR3(p<0.001)和GLP-1R(p<0.01)在转录水平的表达。抗生素具有降低肉鸡结直肠FFAR2和FFAR3基因表达的趋势。这表明,肠道微生物菌群可影响SCFAs的组成及FFARs的表达,改变肠道微生物可影响肉鸡的脂肪沉积;与本研究使用的抗生素相比,益生菌更适合用来研究肉鸡肠道微生物对SCFAs和脂肪代谢的调控作用。肠道微生物菌群对HFD肉鸡脂肪代谢的调控采用高脂日粮(high fat diet,HFD)饲喂肉鸡,试验分为对照组(饲喂HFD基础日粮)、复合益生菌处理组(基础日粮+丁酸梭菌4×105 cfu/g,双歧杆菌2×105 cfu/g,植物乳杆菌2×105 cfu/g,粪肠球菌2×105 cfu/g,总活菌数1×106 cfu/g)和瓜尔胶处理组(基础日粮+0.1%瓜尔胶),探讨肠道微生物对脂肪代谢的影响。结果显示,益生菌和瓜尔胶可显著降低21d肉鸡体增重(p<0.05)和42d腹脂率(p<0.05)。HE染色结果表明,益生菌和瓜尔胶可减少HFD肉鸡肝实质内的脂肪含量,降低肝细胞的空泡坏死率,减少肝脏的脂肪浸润;减小脂肪组织内脂肪细胞的大小。生理生化指标分析发现,与对照组相比,益生菌和瓜尔胶可显著降低21d血浆(p<0.01)和肝脏(p<0.05)内TG的含量,极显著降低血浆ALT的活性(p<0.001)。通过分析脂肪生成关键基因的表达,发现益生菌和瓜尔胶可降低肝脏和脂肪组织中脂肪酸合成酶(FAS)、乙酰辅酶A羧化酶(ACC)、过氧化物酶增殖激活受体-γ(PPARG)、甾醇调节元件结合蛋白-1C(SREBP-1c)等基因在m RNA水平的表达,降低脂肪生成作用,改善HFD肉鸡的脂肪代谢。盲肠微生物分析结果表明,益生菌和瓜尔胶均可提高放线菌门Actinobacteia微生物的相对丰度,提高双歧杆菌Bifidobacterium、弯曲杆菌Campylobacte和乳酸菌Lactobacillu的丰度,降低HFD肉鸡盲肠内变形菌门Proteobacteria和疣微菌门Verrucomicrobia微生物的相对丰度。盲肠SCFAs分析结果表明,益生菌和瓜尔胶均可降低丙酸的比率,提高丁酸的比率。其中,益生菌可显著降低盲肠内丙酸的比率(p<0.05),瓜尔胶可显著提高丁酸的比率(p<0.05)。此外,q PCR分析结果表明,益生菌和瓜尔胶可增加回肠、盲肠,尤其是结直肠中FFAR2、FFAR3和GLP-1R基因在m RNA水平的表达。以上结果表明,肠道微生物可通过SCFAs激活FFARs及其下游靶基因,降低脂肪生成,参与肉鸡脂肪代谢的调控作用。SCFAs在肠道上皮细胞中的信号传递通过SCFAs刺激原代培养的肠道上皮细胞,发现乙酸、丙酸和丁酸均可显著提高FFAR2和FFAR3在m RNA水平的表达,提高肠道上皮细胞GLP-1的分泌,促进GLP-1R基因的表达。通过Western blotting分析发现,三种SCFAs均可显著激活肠道上皮细胞ERK和p38MAPK信号通路,对JNK通路的激活作用相对较弱。通过阻断MAPKs信号通路,发现ERK和p38MAPK抑制剂可完全阻断三种SCFAs介导的GLP-1的分泌(p<0.01)。JNK抑制剂对乙酸介导的GLP-1的分泌没有抑制作用,但可部分抑制丙酸和丁酸介导的GLP-1的分泌。结果表明,与JNK信号通路相比,SCFAs介导的肠上皮细胞GLP-1的分泌更依赖于ERK和p38MAPK信号通路。GLP-1及其类似物Liraglutide对肝细胞脂肪代谢的影响为探讨SCFAs介导的GLP-1对肝细胞脂肪代谢的作用,本研究使用100n M GLP-1处理原代培养的肝细胞24h。结果表明,GLP-1可减少肝细胞内的油红含量,显著降低肝细胞内TG含量(p<0.01)。通过Western blotting分析发现,GLP-1可显著激活肝细胞AMPK(p<0.01),提高其下游靶基因ACC的磷酸化水平(p<0.01)。通过GLP-1类似物Liraglutide处理肝细胞2h,发现100n M Liraglutide可极显著提高肝细胞内p-AMPK/AMPK的水平(p<0.001),显著提高ACC的磷酸化水平(p<0.001),但Liraglutide并不影响肝细胞PPARG和CPT1在蛋白水平的表达。q PCR分析结果显示,Liraglutide可显著激活GLP-1R(p<0.01),降低PPARG(p<0.05)、FABP4(p<0.05)、LPL(p<0.05)和SREBP-1c(p<0.001)等基因的表达。通过Exendin(9-39)阻断GLP-1R,结果发现阻断GLP-1R可逆转由Liraglutide引起的TG含量的下降(p<0.01)。综上表明,GLP-1及其类似物Liraglutide可激活GLP-1R,提高AMPK的磷酸化水平进而刺激ACC的磷酸化,从而减少脂肪酸的从头合成,减少肝细胞内的脂肪沉积。GLP-1类似物Liraglutide对脂肪细胞脂肪代谢的影响通过100n M Liraglutide处理前脂肪细胞,研究Liraglutide对脂肪沉积的影响。结果表明,在前脂肪细胞分化过程中,100n M Liraglutide不仅不会降低细胞内的脂肪沉积,反而具有增加脂肪沉积的趋势,提高脂肪细胞内TG的含量(p<0.05)。整个分化过程中,未能检测到AMPK和ACC的明显变化。因此,Liraglutide对前脂肪细胞脂肪代谢的影响机制还有待于进一步的研究。通过100n M Liraglutide处理成熟脂肪细胞,研究Liraglutide对脂肪沉积的影响。油红O染色结果发现,Liraglutide可减少脂肪细胞内脂滴的含量和脂滴的大小,减少脂肪沉积。与对照组相比,Liraglutide可显著降低脂肪细胞内TG的含量(p<0.01)。通过Western blotting分析表明,Liraglutide处理4~8h,可显著提高细胞内p-AMPK的水平(p<0.05),处理2h即可显著提高细胞内p-ACC的水平(p<0.05)并且,这一作用可以持续到8h。综上结果表明,Liraglutide可减少成熟脂肪细胞的脂肪沉积。综上所述,本研究发现,肠道微生物菌群的改变可影响SCFAs的组成,SCFAs可通过MAPKs信号通路介导肠道上皮L-细胞分泌GLP-1,GLP-1及其类似物Liragluide可激活AMPK减少肝细胞和成熟脂肪细胞的脂肪生成。