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L-苹果酸是一种天然存在的有机酸,具有显著的生理功能,市场发展空间良好。木糖是一种广泛存在的生物质原料,在木质纤维素中含量仅次于葡萄糖。能够有效利用木糖为底物进行工业发酵生产的微生物菌种开发对提高木质纤维素的资源化利用有显著的促进作用。本论文拟开发能利用木糖合成苹果酸的菌株,具有重要的理论和现实意义。论文首先利用λ-Red重组技术,对大肠杆菌内源的三羧酸循环途径进行修改,依次敲除苹果酸合酶基因maeAB、苹果酸脱氢酶基因mdh和富马酸合酶基因簇fumACB,并引入木糖合成乙醇酸途径,构建以木糖为碳源的苹果酸合成途径。研究结果发现,随着敲除基因的增多,细菌生长速率和木糖利用速率逐渐变慢。敲除上述maeAB、mdh和fumACB的MA-05菌株生长速度最慢,其在摇瓶中培养72 h,能积累1.99 g/L的L-苹果酸,同时消耗4.24 g/L的D-木糖,苹果酸得率为0.47 g苹果酸/g木糖,达到理论得率的52%。在此基础上,在MA-05菌株中过表达乙醇酸氧化酶基因簇glcDEF和苹果酸合酶基因glcB、aceB,强化重组菌株的的苹果酸合成途径。研究结果显示,过表达glcDEF和glcB对苹果酸的合成有促进作用,而过表达aceB会明显抑制细胞的生长。同时过表达glcDEF和glcB的MA-10菌株在72 h的摇瓶发酵中,消耗5.22 g/L的D-木糖,同时产生4.53 g/L的L-苹果酸,得率为0.87 g苹果酸/g木糖,达到理论得率的97%,是目前已知的木糖合成苹果酸的最高得率。最后,论文对细胞内的氧化还原水平进行调节,研究了在MA-10菌株中表达NADH氧化酶基因noxE和过氧化氢酶基因katE对细胞生长和苹果酸合成的影响。结果发现,noxE基因的表达有利于细胞的生长,但对苹果酸的合成无促进作用。katE基因的过表达能显著促进细胞生长,并加快L-苹果酸的合成。过表达katE基因的MA-11菌株发酵72 h能积累5.90g/L的L-苹果酸,相比对照菌株提高了 30%。这表明,过表达katE能够降低代谢过程中H202的积累,从而减轻其对细胞生长的毒害作用,从而提高了生物量和苹果酸产量。