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第一部分:胰岛素样生长因子-1对PC12细胞淀粉样前体蛋白(APP)代谢的影响
目的:探讨胰岛素样生长因子-1(insulin-like growth factor1,IGF-1)对大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤(pheochromocytoma12,PC12)细胞淀粉样前体蛋白(amyloid precursor protein,APP)代谢的影响。方法:体外培养PC12细胞,用不同剂量IGF-1(20,40和80ng/ml)作用PC12细胞,以等体积细胞培养液用作对照,24h后ELISA法检测细胞培养液中Aβ1-42水平,Western blotting法检测APP、C99及C83的蛋白表达水平。结果:①IGF-1降低Aβ1-42的水平,随着IGF-1浓度的增加,这种作用更加显著;②IGF-1降低C99蛋白表达水平,同时增加C83的水平,这种作用亦具有浓度依赖性;③IGF-1对APP的蛋白表达水平无显著影响。结论:在PC12细胞,IGF-1能诱导APP代谢从β途径向α途径转变,这种作用具有剂量依赖性。
第二部分:胰岛素样生长因子-1对PC12细胞β位淀粉样前体蛋白裂解酶1(BACE-1)的影响
目的:观察IGF-1对PC12细胞β位淀粉样前体蛋白裂解酶1(β-siteamyloid precursor protein cleaving enzyme1,BACE-1)的影响,探讨IGF-1对APP代谢途径的转变作用是否为BACE-1水平改变所至。方法:体外培养PC12细胞,用不同剂量IGF-1(20,40和80ng/ml)作用PC12细胞,以等体积细胞培养液用作对照,24h后荧光定量PCR法检测BACE-1的mRNA水平,Western blotting法检测BACE-1的蛋白表达水平。结果:①IGF-1降低BACE-1的mRNA水平,随着IGF-1浓度的增加,这种作用更加明显;②IGF-1降低BACE-1的蛋白表达水平,这种作用亦具有浓度依赖性。结论:①IGF-1能降低PC12细胞中BACE-1的mRNA及蛋白表达水平;②IGF-1对APP代谢途径的转变作用可能与BACE-1的水平降低有关。
第三部分:胰岛素样生长因子-1对PC12细胞中P13-K/Akt及MAPKs信号通路的影响
目的:探讨IGF-1对PC12中P13-K/Akt及MAPKs信号通路的影响。
方法:PC12细胞分为6个组:对照组、IGF-180ng/ml组、IGF-180ng/ml+LY29400225μmol/L组、IGF-180 ng/ml+LY29400250μmol/L组、IGF-180 ng/ml+PD9805925μmol/L组、IGF-180ng/ml+PD9805950μmol/L组。PC12细胞在加入IGF-180ng/ml前30min,先加入LY294002(PI3-K抑制剂)或PD98059(MEK抑制剂)。24h后Westernblotting法检测Akt、pAkt、ERK1/2、pERK1/2、p38MAPK、pp38MAPK、JNK、pJNK的水平。结果:①IGF-1增加pAkt及pERK1/2的水平;②IGF-1对pp38MAPK及pJNK水平无明显影响;③LY294002具有抑制IGF-1对pAkt的作用;④PD98059具有抑制IGF-1对pERK1/2的作用。结论:①在PC12细胞中,IGF-1能激活P13-K/Akt及MAPK/ERK1/2信号通路;②IGF-1对BACE-1、C99、C83及Aβ1-42的影响可能与P13-K/Akt及MAPK/ERK1/2信号通路激活有关。
第四部分:P13-K/Akt及MAPK/ERK1/2信号通路对IGF-1改变APP代谢及BACE-1表达的影响
目的:观察LY294002及PD98059对IGF-1改变BACE-1、APP、C99、C83及Aβ1-42表达的影响,探讨IGF-1对APP代谢途径转变及BACE-1表达作用的细胞信号机制。方法:PC12细胞分为6个组:对照组、IGF-180ng/ml组、IGF-18ng/ml+LY29400225μmol/L组、IGF-180ng/ml+LY29400250μmol/L组、IGF-180ng/ml+PD9805925μmol/L组、IGF-180 ng/ml+PD9805950μmol/L组。PC12细胞在加入IGF-180ng/ml前30min,先加入LY294002或PD98059,24h后荧光定量PCR法检测BACE-1的mRNA水平,Western blotting法检测BACE-1、APP、C99及C83的蛋白表达水平,ELISA法检测细胞培养液中Aβ1-42水平。结果:①LY294002及PD98059抑制IGF-1降低BACE-1的mRNA水平;②LY294002及PD98059抑制IGF-1降低BACE=1、C99及Aβ1-42的蛋白表达水平;③LY294002及PD98059抑制IGF-1增加C83的蛋白表达水平。结论:①LY294002及PD98059抑制IGF-1对APP代谢及BACE-1表达的作用,这种作用具有剂量依赖性;②IGF-1对APP代谢途径及BACE-1表达的影响可能与P13-K/Akt及MAPK/ERK1/2信号通路激活有关。