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水貂阿留申病(Aleutian Mink Disease,AD)是具有自主复制能力的水貂阿留申病病毒(Aleutian Mink Disease virus,ADV)引起水貂的一种消耗性、慢性传染病。病毒主要侵害水貂免疫系统,导致机体免疫系统紊乱并继发多器官衰竭,主要特征是终身呈病毒血症、肾小球肾炎、动脉炎、肝炎、易引发细菌感染等临床表现。该病几乎存在于世界上所有野生、人工养殖的水貂种群,抗体阳性率为20%~30%。严重影响水貂种群的国际贸易和经济性状,对世界水貂养殖业造成了极大的经济损失。本研究从辽宁地区发病水貂养殖场成功分离鉴定了ADV地方强毒株ADV-LN株,对其完成VP2全长基因的扩增和序列分析;并以ADV-LN株为实验材料在国内首次完成了对其VP2蛋白的毕赤酵母表达,利用ADV VP2重组蛋白作为检测抗原,建立了间接ELISA方法检测ADV抗体;成功建立了Taq Man-MGB荧光定量PCR、LAMP、PCR-DHPLC三种检测方法并应用于临床检测;获得的毕赤酵母表达蛋白和系列检测技术的建立为该病的检疫、防治、控制奠定了重要基础。具体研究内容分为如下6个部分:1、水貂阿留申病毒ADV-LN强毒株的分离鉴定及其VP2基因的进化分析:对辽宁地区水貂养殖场用CIEP方法进行筛选淘汰AD阳性水貂时,剖检采集阳性水貂临床组织样品(肝、脾、肾、淋巴结等),通过制备组织冷冻切片电镜观察,无菌研磨处理病变组织,经接种猫肾细胞(CRFK),不产生CPE,盲传6代后通过PCR鉴定证明获得ADV,经动物回归试验,实验接种组第38天,出现染病死亡1只,剩余水貂在第50天后,均出现拒食、神经症状、抽搐、步履蹒跚、喜卧不喜动等AD感染典型症状,证明分离到的ADV株为强毒株,命名为ADV-LN株。其后设计引物扩增了ADV-LN株的全长VP2基因,连接p MD18-T载体构建成功克隆质粒p MD18-T-VP2,测序后经过对VP2基因序列分析后证实ADV-LN株和国内外强毒株(ADV-Utah1和ADV-BEIJING株)亲缘关系近,和弱毒株(ADV-G)亲缘关系远。2、ADV VP2蛋白在毕赤酵母中的高效分泌表达及免疫源性鉴定:通过对ADV LN株VP2基因进行了毕赤酵母偏好密码子优化后全基因合成,通过系列分子生物学技术,成攻构建阳性重组菌株X-33/p PICZαA-VP2-opt,使ADV VP2基因成功在毕赤酵母系统中分泌表达,表达量达到总蛋白含量的78%,属于高效表达;SDS-PAGE证实,表达的VP2蛋白比理论上的73KD偏大,约有90KD,但应用ADV阳性血清对重组蛋白进行Western-blot、间接ELISA试验进行免疫原性鉴定后证实,VP2重组蛋白能够和ADV阳性血清有效结合,免疫原性良好。进而对VP2蛋白基因进行氨基酸位点分析发现,其内含有7个N-糖基化位点,推测重组VP2外源蛋白比理论分子量大的原因是氨基酸翻译后被N-糖基化修饰后的结果,通过对VP2重组蛋白进行去糖链试验,显示去糖链后的VP2蛋白条带接近理论分子量73 k D也证明了这点。获得具有真核表达修饰后的VP2重组蛋白意义重大,为ADV基因工程疫苗的研制奠定了基础。3、基于VP2重组蛋白建立检测ADV抗体的间接ELISA方法:基于具有良好免疫原性的ADV-VP2酵母表达重组蛋白,成功建立了检测ADV抗体的间接ELISA方法,通过优化系列ELISA反应条件(血清稀释液和血清稀释度、抗原包被浓度、抗原包被条件、封闭液种类和封闭时间、、血清作用时间、酶标二抗作用时间、底物显色时间),建立了ELISA的最佳反应程序,并通过特异性、敏感性和重复性试验证明本试验建立ELISA方法的可行性,应用本试验建立ELISA方法和CIEP同时检测285份血清样品,两者符合率为95.7%,证明该ELISA方法可特异、灵敏的检测ADV抗体。4、水貂阿留申病毒(ADV)Taq Man-MGB荧光定量PCR检测方法的建立与初步应用:参照Gen Bank上已发表的ADV-G毒株序列,基于设计的特异性引物和探针,成功建立了一种用于检测ADV的Taq Man-MGB荧光定量PCR方法,具有特异性强,敏感性高,可快速定量的特点,该方法对ADV的检测限是10拷贝/μL,和普通PCR比较灵敏性提高了100倍。应用本研究建立的Taq Man-MGB荧光定量PCR方法检测了40份临床样品,阳性率分别为52.5%(21/40),较普通PCR的45%(18/40)提高了7.5%的检出率。本方法的研制为ADV的快速诊断提供了重要储备检测方法。5、水貂阿留申病毒(ADV)环介导等温扩增(LAMP)检测方法的建立和初步应用:参照Gen Bank上已发表的ADV毒株VP2基因序列,针对VP2基因保守区域设计了3对LAMP技术扩增引物,通过对系列实验条件(反应时间、反应温度)进行优化,建立了检测ADV的LAMP检测方法。应用建立的LAMP检测方法,进行了特异性试验和灵敏性试验,在特异性试验中,与CPV、PPV、CEV、CDV等病毒都无交叉反应;进行灵敏性试验时,LAMP的检测限为10拷贝/μL,与荧光定量PCR的检测限相当,比PCR高10倍。在对126份水貂临床样品检测时,LAMP、定量PCR方法阳性检出率为48.4%(61/126),高于普通PCR方法的44.4%(61/126)。该LAMP检测技术为AD的临床诊断与流行病学调查的又提供了一种现场检验方法。6、水貂阿留申病毒(ADV)PCR-DHPLC检测方法的建立及初步应用:参照Gen Bank上已发表的ADV VP2基因序列,设计一对特异性引物,经过对DHPLC各种反应条件的优化,成功建立了一种针对ADV检测的PCR-DHPLC诊断方法,最低检测限为10拷贝/反应,和荧光定量PCR方法的检测限相当,比PCR电泳法高10倍。应用本研究建立的ADV PCR-DHPLC方法检测126份临床样品,检出率为48.4%,高于普通PCR电泳法的检出率,PCR-DHPLC方法检测ADV的成功研制为以后对该病的检测提供了简便、高通量的检测技术储备。