论文部分内容阅读
目的:乌苏烷三萜类化合物3β,19α-二羟基乌苏-12-烯-23,28-二羧酸(Rotundioic acid,RA)是从山绿茶提取的一种乌苏酸的衍生物,本实验观察RA对人红白血病K562细胞增殖和凋亡的影响,并探讨其机制;研究RA对耐阿霉素的K562细胞(K562/ADM细胞)增殖活性及抗肿瘤药物敏感性的影响,并探讨RA对K562/ADM细胞多药耐药作用的影响及机制,进一步探讨RA在白血病的发生、发展及耐药之间的关联,RA有望成为治疗白血病的药物。方法:采用体外细胞培养技术,CCK-8(Cell Counting Kit-8)法检测RA对K562细胞及K562/ADM细胞的增殖抑制作用及抗肿瘤药物敏感性的影响;流式细胞仪用Annexin V-FITC/PI双染色法研究RA对K562细胞凋亡的作用;实时定量PCR(Real-time quantitative PCR,RT-qPCR)和western blot分别在mRNA和蛋白水平对K562细胞中PARP、Bcl-2、Bax、NF-кB p65、caspase-3的表达进行检测;RT-qPCR和western blot检测K562细胞和K562/ADM细胞MDR1 mRNA和蛋白水平,并检测非细胞毒性浓度RA对K562/ADM细胞MDR1 mRNA及P-gp表达的影响;Western blot检测K562/ADM细胞p-JNK、p-p38、p-ERK1/2的表达。数据统计分析采用GraphPad Prism 6和SPSS 18.0软件,两组间比较采用独立样本t检验,多组间比较采用单因素方差分析,用x±s表示,P<0.05表示差异具有统计学意义。结果:RA抑制K562细胞的增殖,呈浓度和时间依赖性,在30μg/ml时增殖抑制作用最明显,24h的IC50为14.94μg/ml;Annexin V-FITC/PI双染色法检测显示RA诱导K562细胞凋亡,呈浓度和时间依赖性,与对照组比较,总凋亡率在高浓度组表现出明显差异(P<0.01)。RT-qPCR和western blot显示:RA上调K562细胞Bax、caspase-3、PARP的mRNA和蛋白表达水平,同时降低Bcl-2、NF-кB p65的转录和翻译水平。CCK-8结果显示RA抑制K562/ADM细胞增殖,呈浓度和时间依赖性;K562/ADM细胞对RA的24h IC50为45.14μg/ml,24h IC10为6.392μg/ml,取4μg/ml为后续实验浓度;RA增加K562/ADM细胞对阿霉素的敏感性,逆转倍数为1.61倍,差异有统计学意义(P<0.05),对K562细胞无明显增敏作用;K562/ADM对ADM的耐药倍数为41.76倍。RT-qPCR和western blot显示:K562细胞内MDR1 mRNA表达极低水平,其蛋白产物P-糖蛋白(P-glycoprotein,P-gp)几乎不表达;K562/ADM细胞MDR1mRNA及P-gp高度表达;且RA下调K562/ADM细胞MDR1的表达水平。Western blot检测发现:RA上调K562/ADM细胞p38、ERK1/2的磷酸化水平,不影响p-JNK的表达,提示RA可能通过调节MAPK信号通路调控MDR1的转录和翻译水平参与逆转白血病多药耐药作用。结论:RA对K562细胞起增殖抑制及促凋亡作用,呈浓度和时间依赖性,其作用可能与上调促凋亡基因(PARP、caspase-3、Bax)的表达及下调抗凋亡基因Bcl-2的表达相关,另外可能与降低NF-кB p65的表达水平相关,可能是通过调控线粒体凋亡途径、NF-кB信号通路及caspase-3信号通路抑制K562细胞增殖并促进细胞凋亡。研究还发现RA可能通过下调K562/ADM细胞p-p38、p-ERK1/2的表达水平参与MAPK信号通路的调节,从而抑制MDR1的转录和翻译水平,最终逆转白血病细胞多药耐药作用。