研究背景大肠癌是最常见的致死性恶性肿瘤之一。早在19世纪Rudolf Virchow便提出炎症与肿瘤之间存在密切联系。越来越多的证据表明,肿瘤相关炎症能够通过促进血管新生和转移、颠覆抗肿瘤免疫应答及改变肿瘤细胞对化疗药的敏感性等方面促进肿瘤的生长和进展。持续性的炎性微环境也能通过触发基因突变从而导致肿瘤发生。持续存在的炎症细胞及因子亦能将肿瘤相关炎性微环境转化为免疫抑制微环境从而促进肿瘤进展。炎症因子IL-23/IL-17调控轴在人大肠癌发生发展中具有重要作用。有研究显示,Th17细胞相关基因表达特征与大肠癌患者无瘤生存率呈负相关。虽然小鼠结肠癌模型研究提示,Th17细胞是大肠癌IL-17的主要来源。但是,人大肠癌IL-17的主要来源问题尚未被直接证明。此外,IL-17及其相关因子促进人大肠癌发生和进展的确切机制尚不清楚。γδT细胞是一类分布于外周血及粘膜组织的非MHC限制性固有T淋巴细胞。最近,γδT细胞被证明是炎症性肠病、银屑病、皮炎及肝炎中主要的IL-17分泌细胞并在疾病发生发展中具有重要作用。小鼠模型研究显示,γδT细胞能够通过分泌IL-17促进肿瘤血管新生。然而,γδT细胞在人类肿瘤相关炎性微环境中的特征及作用尚无研究报道。我们试图研究γδT细胞在大肠癌相关炎症及免疫微环境中的作用及机制。研究方法为了明确炎性γδT细胞在人大肠癌中的鉴定及特征,我们首先通过RT-PCR及ELISA方法检测了人大肠癌及配对正常组织内IL-17A等炎症细胞因子的基因及蛋白质表达水平。然后通过原代细胞分离及流式检测分析IL-17A分泌细胞亚群鉴定。通过组织及细胞培养上清ELISA检测大肠癌组织及其浸润γδT细胞的IL-17A分泌量。最后通过免疫荧光验证ySTCR及几-17A在肿瘤组织的共定位。为了阐明γδT17细胞在大肠癌炎性微环境中的极化及机制。我们首先通过RT-PCR及ELISA对大肠癌配对组织内IL-23基因及蛋白质表达水平进行检测。然后通过激光共聚焦显微镜检测了IL-23与DC细胞标志CDllc及IL-23与巨噬细胞标志CD68在肿瘤组织的共定位。我们通过流式检测分析了肿瘤及配对正常组织中总DC细胞(CD45+HLA-DR+CD11c+)、CD14+DC细胞、炎症性DC细胞(inflammatory dendritic cells (infDCs), CD45+Lin-HLA-DR+CD11c+CD1c+CD16-)及炎症性巨噬细胞(inflammatory macrophages (infMs), CD45+Lin-HLA-DR+CDllc+CDlc-CD16+)的表达情况。同时,我们通过吉姆萨染色及流式分析对流式分选出来的肿瘤浸润infDCs的形态学及表型特征进行了鉴定。然后,我们通过RT-PCR及ELISA对大肠癌配对组织浸润infDCs及infMs的IL-23基因及蛋白质表达水平进行检测。为了进一步解释IL-23在肿瘤组织表达增高的原因,我们将流式分选出来的正常肠粘膜浸润infDCs和infMs在体外条件培养基(热灭活的E.coli.、Pam3、LPS、CD40L、E.coli. DNA或单纯培养基)中孵育3天并通过ELISA检测其上清中IL-23分泌量。为了进一步研究infDCs对γδT17细胞在肿瘤内的极化作用,我们首先将正常肠粘膜分选出来的幼稚γδT细胞与条件培养基(培养基+热灭活的E.coli.、正常组织来源上清、肿瘤组织来源上清、培养基+IL-23、肿瘤组织来源上清+IL-23中和抗体或肿瘤组织来源上清+同型抗体)孵育14天并通过流式检测γδT17细胞在总γδT细胞中的比例。最后,我们将从正常组织分选出来的infDCs通过体外条件培养基(培养基十热灭活的E.coli.)预激活3天,然后我们将不同预处理后的infDCs (未预激活的infDCs及预激活的infDCs)与正常粘膜分选出来的幼稚γδT细胞于条件培养基(培养基含/或不含IL-23中和抗体或IL-23同型抗体)中共培养14天,最后我们通过多色流式分析检测γδ3T17细胞在总γδT细胞中的比例。为了研究肿瘤浸润IL-23分泌型infDCs增高的潜在机制,我们首先通过免疫荧光染色检测瘤内、癌旁及相对正常组织内紧密连接蛋白(ZO-1及claudin-2)表达情况。为了进一步阐明肿瘤上皮完整性缺失与瘤内细菌侵入的关系,我们通过RT-PCR (Real time PCR)、ELISA (Enzyme linked immunosorbent assay)及FISH (Fluorescence in situ hybridization)的方法检测肿瘤及配对正常组织内细菌16sRNA及细菌产物LPS (Lipopolysaccharide)的含量。为了进一步研究肿瘤内γδT17细胞增高对肿瘤炎性微环境的影响及机制,我们首先通过ELISA检测了预激活infDCs对肿瘤浸润γδT17细胞分泌细胞因子的影响。同时我们通过多色流式分析及ELISA检测肿瘤及配对正常组织浸润γδT17细胞的IL-8. GM-CSF及TNF-a分泌情况。然后,我们通过多色流式分析检测潜在受到肿瘤浸润γδT17细胞影响的MDSCs (Myeloid-derived suppressor cells)亚群在肿瘤及配对正常组织的比例(数量),并通过吉姆萨染色、ELISA、DCFDA (2’,7’-Dichlorofluorescein diacetate)染色及共培养实验鉴定流式分选出来的肿瘤浸润主要MDSCs亚群的形态学特征、arginase I分泌、ROS (Reactive oxygen species)含量及T细胞抑制功能。通过多色流式分析,我们比较了肿瘤、配对正常组织及同源周血与及健康人的外周血内PMN-MDSCs (Polymorphonuclear myeloid-derived suppressor cells)的数量。最后,我们将肿瘤浸润γδT17细胞或细菌裂解产物预激活infDCs诱导的γδT17细胞与流式分选出来的PMN-MDSCs共培养,并通过细胞计数及流式分析检测γδT17细胞对PMN-MDSCs趋化、增殖及存活的影响。为了研究肿瘤浸润γδT17细胞与大肠癌临床病理特征、肿瘤浸润免疫细胞及炎症细胞因子的相关性,首先我们分析了肿瘤浸润γδT17细胞百分率及绝对数量与肿瘤分期(型)的相关性。然后我们分析了肿瘤浸润γδT17细胞百分率与肿瘤大小、淋巴结浸润、血管浸润、肿瘤局部浸润、淋巴结转移、肿瘤分化及血液CEA(Carcino embryonie antigen)浓度的相关性。最后我们分析了肿瘤浸润γδT17细胞百分率与infDCs百分率、PMN-MDSCs百分率、IL-23浓度及IL-17A浓度的相关性。研究结果1.炎性yST细胞在人大肠癌中的鉴定及特征。IL-17A的基因及蛋白质表达水平在人大肠癌组织均明显增高。肿瘤内分泌IL-17A的细胞主要为CD3+T淋巴细胞。无论是IL-17A分泌型CD45+细胞还是CD3+T细胞均明显增高。肿瘤内CD8+T(Tc17)细胞、CD4+T(Th17)细胞及γδTCR+T细胞均能分泌IL-17A。Tc17、Th17及γδT17细胞的百分率及绝对数量在大肠癌中均显著增高。然而,γδT17细胞在大肠癌中的数量显著高于Tcl7及Th17细胞。通过免疫荧光染色在肿瘤内能够清楚的看到肿瘤浸润γδT17细胞。肿瘤浸润γδT细胞分泌IL-17A的量明显高于配对正常肠粘膜浸润γδT细胞,而IFN-γ分泌量未见明显差异。80%-90%的肿瘤及配对正常肠粘膜浸润γδT细胞表达CD69,而少于50%的同源外周血γδT细胞表达CD69。少量肿瘤浸润γδT17细胞同时分泌IL-17A和IL-17F。大多数肿瘤浸润γδT17细胞同时分泌IL-17A和TNF-α,但不分泌IFN-γ。肿瘤浸润γδT17细胞分泌TNF-α的量明显高于配对正常组织。相反,肿瘤浸润Th17细胞仅分泌少量的TNF-α。肿瘤及配对正常肠粘膜浸润γδT17细胞均未见明显的IL-22. IL-10及IL-4分泌。表型方面,67.4%-83.6%的肿瘤浸润γδT17细胞为Vδ1+细胞,仅少于10%的肿瘤浸润γδT17细胞为Vδ2+细胞。肿瘤浸润γδT17细胞高表达CD45RO、CD161及CCR6,但不表达granzyme B、perform、FasL、TRAIL NKG2D、NKp30、NKp44、NKp46、CD25和CD122。有趣的是,大多数正常组织中γδT17细胞为中央记忆T细胞(TCM, CD45RA-CD27+),而肿瘤浸润γδT17细胞大多为效应记忆T细胞(TEM, CD45RA-CD27-)。分布上,肿瘤浸润γδT17细胞数量在肿瘤边缘(大约12%-24%)及瘤内(大约8%-13%)均明显高于配对正常组织(大约1%-6%)。2.γδT17细胞在大肠癌炎性微环境中的极化及机制。IL-23p19转录水平及IL-23蛋白水平在肿瘤组织内明显增高。免疫荧光染色显示,IL-23p19在肿瘤组织与CD11c+DC细胞共定位,但我们未见其与CD68+巨噬细胞在肿瘤内的明显共定位。为了明确IL-23在肿瘤内的细胞来源,我们检测了肿瘤浸润总DC细胞(CD45+Lin-HLA-DR+CD11c+)及不同DC细胞亚群的IL-23表达情况。我们发现肿瘤浸润总DC细胞和CD14+DC (CD45+Lin-HLA-DR+CD11c+CD14+)细胞的百分率及数量均明显高于配对正常组织及同源外周血。进一步的研究显示,infDCs和infMs在肿瘤内均明显增高。形态学分析显示肿瘤浸润infDCs具有明显的树突状结构和DC细胞形态,而infMs为典型的巨噬细胞形态。表型上,肿瘤浸润infDCs高表达CD80、CD83、CD86、PD1、CD206、HLA-DR及CD11c,提示这些细胞为具有负向免疫调节潜能的未成熟DC细胞。进一步研究显示,肿瘤浸润infDCs的百分率及绝对数量均明显高于配对正常组织、同源外周血及正常人外周血。肿瘤浸润炎症性巨噬细胞也明显高于配对正常组织,但炎症性巨噬细胞的百分率及数量在肿瘤与同源外周血及正常人外周血之间并无明显差异。肿瘤浸润infDCs表达的IL-23在转录水平及蛋白水平均明显高于配对正常组织浸润infDCs.热灭火的E.coli.、Pam3、LPS和CD40L体外能激活infDCs并促进其IL-23分泌。与配对正常组织相比,肿瘤组织来源的上清通过IL-23诱导正常肠粘膜来源的γδδT细胞分泌IL-17。更重要的是,细菌产物预激活的infDCs能够通过分泌IL-23有效诱导γδT17细胞的极化。为了明确导致大肠癌组织浸润infDCs激活的细菌产物的来源问题,我们检测了肿瘤组织上皮完整性。通过ZO-1、claudin-2和pan-cytokeratin免疫荧光共染我们发现,紧密连接蛋白ZO-1和claudin-2在肿瘤内表达减少并排布紊乱,提示肿瘤内上皮完整性缺失。对新鲜组织内LPS含量检测发现,肿瘤匀浆来源上清内LPS含量明显高于配对正常组织。进一步的研究发现,肿瘤内细菌16sRNA含量明显高于配对正常组织,且细菌侵入主要集中于肿瘤边缘。3.γδT17细胞促进大肠癌免疫抑制及肿瘤进展。在细菌产物预激活infDCs与γδT细胞共培养体系中,我们发现体外预激活infDCs能够诱导γδT细胞分泌IL-8、TNF-α、GM-CSF及IL-17。γδT细胞的IL-17A、IL-8和GM-CSF分泌部分依赖于infDCs来源的IL-23,而TNF-a分泌不依赖于IL-23。胞内细胞因子流式检测显示,50%以上的肿瘤浸润γδT17细胞同时分泌IL-8、TNF-a及GM-CSF。IL-8+γδT17细胞、TNF-α+γδT17细胞和GM-CSF+γδT17细胞在肿瘤内明显增高。相反,肿瘤浸润Th17的IL-8、TNF-α及GM-CSF分泌量未见明显增高。通过对CD161+CCR6+γδT17细胞培养上清ELISA检测发现,肿瘤浸润CD161+CCR6+γδT17细胞IL-8、TNF-α及GM-CSF分泌量明显高于配对正常组织浸润CD161+CCR6+γδT17细胞。同时,通过对大肠癌浸润MDSCs检测分析我们发现,一群以CD45+Lin-HLA-DR-CDllb+CD33+CD66b+为特征的PMN-MDSCs在肿瘤内明显高于配对正常组织。通过MDSCs特征鉴定,我们发现该细胞具有分泌arginase-I、ROS和抑制T细胞增殖及分泌IFN-γ等特性。形态学分析显示,该细胞为典型的多核细胞。进一步的研究发现,PMN-MDSCs的百分率及绝对数量在大肠癌内均显著高于配对正常组织、同源外周血及健康人外周血。更重要的是,大肠癌内PMN-MDSCs的数量是M-MDSCs的80多倍。为了研究大肠癌组织浸润γδT17细胞对PMN-MDSCs及肿瘤免疫微环境的潜在影响。我们通过体外共培养体系研究发现,体外诱导γδT17细胞及肿瘤浸润γδT17细胞均能够通过IL-8及GM-CSF促进PMN-MDSCs趋化。γδT17细胞分泌的IL-17A及GM-CSF能够在24小时内显著促进PMN-MDSCs增殖。更重要的是,体外γδT17细胞能够通过分泌IL-8、IL-17A及TNF-α促进PMN-MDSCs的存活。通过对大肠癌浸润γδT17细胞数量与病人临床分期的相关分析,我们发现肿瘤浸润γδT17细胞百分率及绝对数量与TNM分期呈正相关。大肠癌浸润γδT17细胞百分率与其他临床病理特征-肿瘤大小、淋巴管及血管浸润、肿瘤局部浸润、肿瘤分化、淋巴结转移及血清CEA水平呈正相关。通过对另一组病人数据的分析,我们发现肿瘤浸润γδT17细胞数量与infDCs、PMN-MDSCs、IL-23和IL-17A呈正相关。另外,肿瘤内IL-23与infDCs及IL-17表达量呈正相关。结论我们的研究首次明确证明了固有γδT细胞是人大肠癌内IL-17的主要来源。机制上,肿瘤上皮完整性的缺失导致共生菌及其产物侵入肿瘤,从而激活infDCs并促进其IL-23分泌。infDCs分泌的IL-23诱导γδT17细胞的肿瘤内极化并促进其分泌IL-8、GM-CSF、TNF-α及IL-17A等炎症因子分泌。最终,肿瘤浸润γδT17细胞通过这些炎症因子促进PMN-MDSCs在肿瘤的趋化、增殖及存活从而为肿瘤细胞营造一个免疫抑制微环境。我们同时也发现,肿瘤浸润γδT17细胞与肿瘤相关临床病理特征相关。因此,我们的研究提示γδT17细胞在人大肠癌发生和进展中具有重要作用,也为大肠癌的临床干预研究提供了新的思路。