目的 1、探讨以壳聚糖为主要材料构成的组织工程角膜支架的生物相容性。 2、培养保持正常表型的三种角膜细胞。 3、试用壳聚糖支架材料构建组织工程角膜基质方法。 (一)以壳聚糖为主要材料构建的组织工程角膜支架的生物相容性比较及筛选 1、壳聚糖为主要材料的组织工程角膜支架的构建： (1)将壳聚糖、胶原蛋白、硫酸软骨素、透明质酸钠等溶液按照90:6:2:2的比例混合，以原花青素和戊二醛溶液作为交联剂分为两组，分别制成不带孔和带孔的两种支架。 (2)分别测量带孔支架的含水率和膨胀率；对四种壳聚糖支架做石蜡切片染色观察合成的支架的孔径等形态。 2、壳聚糖支架材料生物相容性比较及筛选实验：40只新西兰大白兔分为A、B、C、D、E5组，每组8只，取右眼为手术眼。A、B两组分别为原花青素和戊二醛交联的带孔支架材料组，C、D两组分别为原花青素和戊二醛交联的不带孔支架材料组，E组为空白对照组。每组制作直径6mm的囊袋，分别植入四种支架材料，每日观察记录角膜水肿、浸润及新生血管情况，在1周、4周、6周、2月、4月、6月、9月、10月、11月等进行裂隙灯显微镜观察照相，并取材行组织病理学检查。比较不同的支架材料对角膜的影响。 (二)培养保持正常表型的三种角膜细胞 1、角膜上皮细胞培养：取新西兰大白兔角膜缘组织置于培养板和羊膜上，加入DMEM/F12。 2、角膜基质细胞培养：角膜基质组织剪成1mm左右组织块，分别置于培养板和羊膜上，加入DMEM/F12。将培养板中培养的角膜基质细胞分A、B两组，待培养板中的细胞80％融合后传代，A组改用含添加剂的DMEM无血清培养基；B组和羊膜上培养组继续用DMEM/F12(内含10％胎牛血清)培养。 3、角膜内皮细胞培养：将含有内皮细胞的后弹力层内皮面朝下置于培养板中，加入DMEM/F12。 4、培养的三种角膜细胞的观察及生物学性质(1)形态观察：倒置显微镜下每日观察细胞形态。 5、免疫组化检测：检测角膜上皮细胞特异性角蛋白K3、K12(AE5)，角膜基质细胞的中间丝蛋白(Vim)，角膜内皮细胞的神经纤维丝蛋白(NF)。 6、分子生物学检测：RT-PCR检测在羊膜和培养板上A、B两组培养的角膜基质细胞特异性keratocan蛋白的表达。 (三)培养的三种角膜细胞分别与筛选出的原花青素交联的壳聚糖支架共培养构建角膜基质 1、三种角膜细胞与壳聚糖支架共培养支架与三种角膜细胞分别共培养，HE染色作组织病理检测。 2、带有上皮细胞的支架做兔角膜板层移植16只新西兰大白兔平均分为两组，每组取右眼为手术眼，5mm环钻钻取约1/3角膜厚度的板层组织，分别移植带上皮细胞的原花青素交联的两种支架，每日观察。 结果 (一)壳聚糖为主要材料按比例合成的组织工程角膜支架的生物相容性及筛选 1、壳聚糖为主要材料的组织工程角膜支架的构建： ①大体形态：原花青素交联的不带孔的支架呈棕色，具有一定的透明度，戊二醛交联的支架呈透明的薄膜；原花青素交联的带孔的支架呈棕色，不透明，有空隙，戊二醛交联的支架，呈白色，不透明，海绵状。 ②.带孔的组织工程角膜支架的特点：含水率：77.8％；膨胀率：76.0％ ③.HE染色：(1)带孔的支架：支架材料红染，具有不规则的孔径，连成网状，原花青素交联的支架孔径比戊二醛交联的规则，多呈四角形，戊二醛交联的支架呈多角形，连成网状。 (2)不带孔的支架：单层红染无孔隙的膜。 2、壳聚糖为主的支架材料生物相容性实验及筛选： (1)裂隙灯显微镜观察记录眼部一般情况： 术后A、B两组较C、D两组炎症反应重，角膜水肿明显；E组炎症反应最轻，基本保持透明。 ①带孔的支架A、B组：术后1周实验组共有3只眼植片脱落，其中A组1只眼，B组2只眼。A、B两组术后1周都有结膜睫状充血、角膜水肿情况。2周后充血水肿逐渐消失，B组消失最晚。术后3周A组5只眼长入角膜新生血管，B组有6只眼；术后6周都有新生血管长入，B组较A组多，A组支架材料的棕色变浅，B组呈白色；术后4个月仍有较多新生血管，术后6月A、B两组新生血管开始变小；9月时材料大部分降解，10月A、B两组的植入材料仍未完全吸收，角膜中少量新生血管长入，11月时新生血管基本消失。12月后两组角膜透明，仅见轻微瘢痕。 ②不带孔的支架C、D两组：术后仅有C组1只眼支架发生脱落，两组角膜水肿和浸润情况无明显差别，1月时均有新生血管长入，术后2月新生血管开始变小，4个月内两组的植入材料均透明，材料已大部降解；5月后角膜透明，仅见轻微瘢痕；6个月时完全透明，未见明显瘢痕。③对照组E组：仅术后2天角膜轻度水肿，以后水肿消退，角膜透明，无感染，无新生血管生长。 (2)组织病理与免疫组化： ①带孔支架的A、B两实验组取不同时间的标本HE染色：2周时两组支架材料中有大量的炎症细胞，B组炎症细胞较A组多，两组均有少量的基质细胞长入，E组角膜标本与正常角膜无区别。3月后A、B两组植入支架材料区域上皮细胞增厚，表层上皮完整，材料周边有新生胶原和角膜基质细胞。材料部分降解，并可见材料碎片。10月时材料基本吸收，已被新生胶原和角膜基质细胞取代，免疫组化结果显示基质细胞的非特异性抗体Vim染色阳性。12月基本与正常角膜相同。②不带孔支架的C、D两组取不同时间的标本HE染色：2周时无明显炎症细胞反应，4月时材料已经大部分吸收，角膜中遗留空隙；5月时空隙基本消失。 (二)培养的保持正常表型的三种角膜细胞 1、上皮细胞培养：上皮细胞生长旺盛，大部分保持正常细胞形态，AE5染色呈阳性。 2、基质细胞培养：在羊膜和培养板上原代培养的细胞及无血清培养基条件下的传代细胞均保持正常的角膜基质细胞形态，分子生物学检测keratocan蛋白阳性表达；Vim染色呈阳性。 3、内皮细胞培养：内皮细胞在培养板上生长良好，NF染色阳性。 (三)培养的三种角膜细胞分别与所筛选出的原花青素交联的壳聚糖支架共培养构建组织工程角膜基质 1、三种角膜细胞与壳聚糖支架共培养： 角膜上皮细胞、基质细胞可以在支架上生长，HE染色显示细胞均在支架表面生长，支架内部几乎没有细胞长入。内皮细胞较难在支架表面上生长。 2、带有上皮细胞的支架板层移植壳聚糖支架周边逐渐变白，角膜轻度水肿，1周时不带孔支架全部脱落，2周时带孔支架全部脱落。 结论： 1、原花青素交联壳聚糖、胶原蛋白等组成的支架材料对角膜组织的刺激性小，与角膜组织具有良好的生物相容性，原花青素可能比戊二醛更适合作为组织工程角膜支架材料的交联剂。 2、可以通过合适的培养方法和条件获得保持正常表型的三种角膜细胞。 3、壳聚糖支架与角膜上皮细胞和基质细胞共培养可以获得初步的组织工程角膜基质，但由于所合成的壳聚糖支架的强度和韧度等较差，仍需进一步寻找合适的构成比例和添加物进行改进。