【摘 要】
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目的:探讨金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus,S.aureus）的小菌落变异（Small colony variant,SCV）骨内定植在假体周围感染（Periprosthetic Joint Infection,PJI）发病中的作用及其机制,为开发PJI新的治疗靶点提供依据。方法:PJI的诊断采用美国肌肉骨骼感染协会（The American Society for Mu
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目的:探讨金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus,S.aureus）的小菌落变异（Small colony variant,SCV）骨内定植在假体周围感染（Periprosthetic Joint Infection,PJI）发病中的作用及其机制,为开发PJI新的治疗靶点提供依据。方法:PJI的诊断采用美国肌肉骨骼感染协会（The American Society for Musculoskeletal Infection,MSIS）标准,以3个月为界,将PJI患者分为急性PJI和慢性PJI。（1）经伦理委员会审批后,术中采集PJI患者的关节液、假体周围组织及超声裂解液,进行微生物培养,观察S.aureus的菌落形态、生长特性并进行毒力基因表达水平检测。（2）术中收集PJI患者的骨组织标本,选取致病菌为S.aureus患者的骨组织标本用于后续研究:骨组织脱钙后,分别采用透射电镜、抗S.aureus抗体孵育后用免疫荧光观察急、慢性PJI患者中S.aureus的骨内定植情况。（3）采用S.aureus的正常表型菌株及SCV菌株,进行以下实验:1)用绿色荧光标记S.aureus,将标记后的正常表型菌株及SCV菌株在体外感染成骨细胞,利用流式细胞学及激光共聚焦技术观察S.aureus在成骨细胞内的定植情况;2)用S.aureus正常表型菌株及SCV菌株构建PJI小鼠模型,收集小鼠骨组织,再次利用透射电镜及免疫荧光观察骨组织内细菌的定植情况。（4）选取经透射电镜及免疫荧光确认存在S.aureus骨内定植的慢性PJI骨组织及未存在S.aureus骨内定植的急性PJI骨组织标本,提取RNA后进行转录组学测序,对测序结果进行聚类分析、主成成分分析（Principal Component Analysis,PCA）、基因本体分析（Gene Ontology,GO）和京都基因与基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG）信号通路富集分析,并对生物信息分析结果进行PCR验证。结果:（1）慢性PJI中,其术中采集标本进行微生物培养可以分离出SCV表型菌株,具有生长缓慢、直径较正常表型菌株小、毒力基因表达水平低下等特点,而在急性PJI中未分离出SCV菌株。（2）在慢性S.aureus PJI骨组织中,利用免疫荧光及透射电镜均可观察到S.aureus在骨组织中定植现象,而急性S.aureus PJI中并未观察到此现象。（3）用分离出的正常表型菌株和SCV菌株体外感染成骨细胞后,流式细胞及激光共聚焦表明SCV菌株更容易侵入成骨细胞;构建PJI小鼠模型,在体内实验亦表明与正常表型菌株相比,SCV菌株更容易在骨组织内定植。（4）转录组学测序结果表明,慢性PJI与急性PJI骨组织标本的基因表达谱存在显著差异,GO分析及KEGG分析显示这些差异表达的基因富集到趋化因子相关信号通路,PCR结果亦证明在慢性PJI骨组织中,趋化因子的表达水平显著低于急性PJI。结论:S.aureus的SCV表型菌株具有更强的侵入、定植于骨组织的能力。与正常表型菌株相比,SCV表型菌株感染后可能通过降低骨组织中趋化因子的表达水平,使中性粒细胞等免疫细胞无法被快速、有效地募集到感染区域并对S.aureus进行清除,S.aureus得以在骨组织中定植,从而介导了慢性PJI的发病。
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