梨(Pyrusspp.)是世界最重要的落叶果树之一。果皮色泽不仅是梨一种重要的农艺性状和外观品质,而且在其价格定位和吸引消费者方面都具有不可忽视的作用。现在梨果皮色泽的形成机制和调控机理仍不清楚。对褐色梨转色关键期进行深入研究,不仅有助于对梨果皮色泽形成机理的探索,同时也对推进梨色泽相关分子育种十分重要。公共数据库中梨转色关键期数据缺乏,严重阻碍了对其的研究。高通量转录组测序技术为我们对梨转色关键期研究提供了一种快速、便捷和可靠的策略。为对梨果皮色泽形成调控机理进行进一步的研究,我们使用Solexa/IlluminaHiSeqTM2000测序平台对(6周、7周、8周和9周)等4个时期的砂梨品种’黄花’梨(Pyrus pyrifolia Nakai’Huanghua’)的果皮转录组进行全面的分析,筛选与色泽形成相关的基因并进行表达分析,同时还分析了 SSR和SNP位点,开发了大量可靠的SSR引物。主要研究成果如下:1.转录组测序和原始序列处理后,得到53 856 740条可用序列,总数据量超过4.8G。对可用序列进行从头组装和同源转录本聚类,得到75 764条unigene(平均长度 735 bp,N50 为 13 10 bp)。将这 75 764 条 unigene 与 Nr、Nt、KEGG、Swiss-prot、GO和COG等6个公共数据库进行比对(E值小于10-5),共有53 268条unigene被注释或分类,其中注释到KEGG数据库中的27492条unigene(36.29%)被发现参与了 128个已知的代谢或信号通路。Pathway代谢通路分析,发现大量的unigenes被注释到一些次生代谢途径中。这些次生代谢过程对梨果皮的色泽形成起关键作用,其中主要是’苯丙烷类生物合成’(Phenylpropanoidbiosynthesis,ko00940)和’类黄酮类化合物生物合成’(Flavonoid.biosynthesis,ko00941)。对这 75 764 条 unigene 进行了编码蛋白框(CDS)的预测分析,其中的72 673条可以通过与数据库比对确定编码蛋白框和方向,另外3 091序列的编码区序列使用软件ESTScan预测。2.从被注释到次生代谢、苯丙烷类代谢和类黄酮代谢三个途径中选择20个unigene在’黄花’梨果皮色泽形成的四个时期进行qRT-PCR分析。结果显示,17个基因在花后6周、7周、8周和9周四个时期的果皮中表达量呈现相似的变化规律,其趋势上总体呈现先升后降的趋势。这从一定程度上也表明了 6-9周已基本覆盖了果皮转色期转录水平变化的整个过程,进一步验证了我们对转色关键期判断的准确性。7周、8周梨果皮次生代谢活动、苯丙烷类代谢和类黄酮类代谢活动表现较为活跃,达到高峰。3.利用获得的75 764条unigene挖掘砂梨SSR和SNP位点并开发相关引物。检测了55 676 271 bp序列信息后,共得到SSR位点10 622个,分布于9 154条unigene中,出现频率为14.02%。SSR位点平均长度为16bp,平均距离为5.24kb。其中以二核苷酸重复类型为主导,占总SSR位点的55.87%。SSR共包含159种重复基元,其中AG/CT处于优势地位,占到总SSR的49.64%。筛选符合条件的SSR位点对其两端相对保守的序列设计引物,并对引物进行筛选,最终得到4 300对符合条件的SSR引物。从中随机选取40对引物进行PCR扩增和聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)分析,结果31对引物可以成功扩增出较为清晰的条带,其中28对引物在预期产物长度附近有条带分布,其他3对引物扩增产物长度小于预期产物长度。将包含SSR位点的9 154条unigene序列注释到GenBankNr蛋白数据库、Nt核苷酸数据库和Swiss-prot数据库中,并对其进行GO分类和COG分类注释。使用SOAPsnp软件查找SNP,共发现SNP 162 048个,其中转换102 342个,颠换59 706个。SNP发生频率为1/344 bp。在所有变异类型中,A/G和C/T发生频率最高,分别达31.66%和31.50%。将包含SNP位点的25 589条unigene序列注释到GenBankNr蛋白数据库、Nt核苷酸数据库和Swiss-prot数据库中,并对其进行GO分类、COG分类注释和代谢通路注释(KEGG pathway),结合已有研究,筛选到1178个可能与果皮色泽形成相关的SNP。