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溶杆菌属于黄单胞科(Xanthomonadaceae),溶杆菌属(Lysobacter),是一类环境友好、但较难分离的有益革兰氏阴性细菌。产酶溶杆菌(L.enzymogenes)是溶杆菌的一个典型种,也是目前研究较多的一种重要的生防细菌。HSAF(HeatStableAntifungal Factor)是产酶溶杆菌体内合成的一种结构和作用方式新颖的小分子抗菌物质。该物质毒性低、对热稳定、广谱抗真菌卵菌,具有开发为新型生物杀菌剂或抗菌药物的应用前景。环二鸟苷酸(c-di-GMP)是细菌体内广泛存在的一种核酸类第二信使。该物质由2分子GTP在具有GGDEF保守结构域的鸟苷酸环化酶(DGCs)的催化下合成,并可被含有EAL或HD-GYP结构域的磷酸二酯酶(PDEs)降解。当细菌接受某些特定的信号后,会激活或抑制相应PDEs或DGCs的活性,从而改变胞内c-di-GMP含量,进而通过c-di-GMP下游特异的受体来调控细菌一系列重要的生理生化功能。过去十几年对c-di-GMP的研究多数集中在动植物病原细菌中,在生防细菌中c-di-GMP信号途径在小分子抗菌物质生物合成方面的研究鲜有报道。本研究以具有自主知识产权的产酶溶杆菌OH11为对象,旨在研究该菌株中c-di-GMP代谢蛋白(PDE和DGC)的酶活及其对HSAF生物合成的调控作用。主要研究结果如下:通过生物信息学分析,从产酶溶杆菌OH11的全基因组中鉴定了 26个负责c-di-GMP代谢的相关蛋白,包括14个仅含有GGDEF结构域的蛋白(即可能具有DGC活性);6个同时具有GGDEF和EAL结构域的蛋白(即可能同时具有DGC和PDE活性);1个只含有EAL结构域的蛋白(即可能的PDE);5个HD-GYP蛋白(可能的PDEs)。在此基础上,本文采用基于大肠杆菌MG1655及其衍生菌株(△yhjH)游动性的方法来检测每个代谢蛋白的酶活(DGC或PDE)。若待测蛋白为DGC,则这个蛋白的表达会使MG1655菌株的游动性显著降低;若待测蛋白为PDE,则该蛋白的表达可恢复或者部分恢复△yhjH突变株游动性丧失的表型。本文首先采用具有已知生化功能的DGC(Slr)和PDE(YhjH)验证了该检测体系的有效性。之后将产酶溶杆菌26个c-di-GMP代谢蛋白的编码基因逐一克隆至蛋白表达载体中,并分别导入MG1655和△yhjH中。基于菌体游动性的检测结果表明:待测的14个GGDEF蛋白中有9个具有较强的DGC活性,这些蛋白的表达导致MG1655的运动性较对照菌株相比显著下降;在6个GGDEF-EAL蛋白中,1个蛋白被检测出DGC活性,其余5个在所测条件下即无DGC也无PDE活性;在所测的6个潜在PDE中,只有1个HD-GYP蛋白被检测出具有较弱的PDE活性。在酶活检测的基础上,我们采用过量表达的方法研究了 26个基因对HSAF合成的调控作用。HSAF的定量检测结果表明,10个DGC的编码基因过表达后,HSAF的产量显著下降,揭示产酶溶杆菌中c-di-GMP抑制HSAF的生物合成。与此结果相吻合,在OH11菌株中过量表达1个已知的DGC(Slr)则可以显著下降HSAF的产量。同时,我们发现5个退化的GGDEF结构域蛋白(即没有检测到DGC活性)过表达后也能导致HSAF的产量下调,揭示这些蛋白有可能作为c-di-GMP的受体来调控HSAF的生物合成。本研究初步建立了产酶溶杆菌中c-di-GMP代谢蛋白的酶活检测体系,并鉴定了数个可调控HSAF生物合成的DGCs,为后续深入研究c-di-GMP信号途径调控HSAF合成的分子机理提供了方法、基因和菌株的支撑。