骨缺损在临床上可因肿瘤切除、创伤、炎症等情况出现,导致患者缺损区形态和功能上的较重的损害,是一个非常值得重视的临床问题。在骨缺损的治疗中,自体骨移植被认为是金标准。由于自体骨的来源有限、形态体积受到限制以及可能造成供区并发症等问题,组织工程骨作为其替代品得以发展。组织工程骨包含了三个要素：组织工程支架、种子细胞和生物活性成分。在骨组织工程的研究中,骨缺损模型众多,如鼠类的颅骨缺损、股骨节段性缺损等,本研究采用一种新的自制不锈钢内固定系统来构建小鼠的股骨节段性缺损,并探索了在一定观察期骨缺损模型的有效性。结缔组织生长因子(CTGF)是一种广泛参与骨发育及再生过程的分泌型基质蛋白,是CCN蛋白家族的第2个成员,又名CCN2。在软骨和骨的发育过程中,CTGF在其中呈现高表达并参与调控整个软骨及骨的发育过程。在软骨及骨的愈合过程中,CTGF同样深度参与。既往的许多体内及体外的研究均证明CTGF能够在许多细胞培养中及体内诱导并加强成骨分化。所以,CTGF有潜力作为一种生物活性因子用于骨组织工程。小鼠颅骨前成骨细胞系MC3T3-E1常用作模式细胞进行体内外成骨细胞相关的研究,在一般情况下,MC3T3-E1细胞系显示出前成骨细胞的特征。对其进行的分群显示其中第4和14亚群具有最强的成骨能力。MC3T3-E1细胞的这种特性决定了其可以作为种子细胞进行骨组织工程有关的研究。本研究采用搭载有重组小鼠CTGF基因的慢病毒转染MC3T3-E1细胞,使其过表达CTGF,在体外研究其成骨向分化的变化；而后作为种子细胞接种在壳聚糖-p磷酸三钙支架上用于修复小鼠的股骨节段性缺损,研究CTGF过表达的细胞对骨缺损的修复效果。实验一慢病毒转染过表达CTGF对MC3T3-E1细胞系增殖、分化、迁移的影响目的：探索慢病毒转染过表达CTGF的MC3T3-E1细胞系在成骨向分化的变化,以及探索该细胞在增殖、迁移等方面的变化。方法：利用GFP标记的慢病毒搭载重组小鼠CTGF基因,转染至MC3T3-E1细胞系,获得过表达CTGF的细胞。而后用成骨诱导培养基培养不同时间段后,分别提取总RNA、总蛋白进行Reat-time PCR检测和Western blot检测,并采用偶氮偶联法及PNPP法定性和定量检测碱性磷酸酶ALP活性,用茜素红染色来检测矿化结节量,以评价过表达CTGF对MC3T3-E1成骨向分化的影响。另外,通过CCK-8试验来检测细胞增殖情况,以评价过表达CTGF对MC3T3-E1增殖的影响；Pranswell迁移试验来检测细胞迁移能力,用以评价CTGF对MC3T3-E1迁移影响。结果：慢病毒介导的转染成功地使MC3T3-E1细胞在mRNA水平和蛋白水平过表达CTGF; Real-time PCR结果显示过表达CTGF的细胞成骨相关标记基因OPN、Runx2和Osterix均明显上升；Western blot结果显示过表达CTGF的细胞对应的成骨相关标记蛋白均明显上升；定量及定性ALP活性实验均显示过表达CTGF的细胞内ALP活性明显升高；茜素红实验显示过表达CTGF的细胞比对照组形成了更多的钙化结节。CCK-8试验结果显示CTGF过表达组与对照组相比,细胞增殖无明显变化；Transwell试验显示CTGF过表达组的细胞迁移增加。结论：CTGF过表达在体外实验中能促进MC3T3-E1细胞的成骨向分化,同时提高其迁移能力,但对增殖能力没有明显影响。这表明过表达CTGF的MC3T3-E1细胞能够作为种子细胞用于骨缺损修复。实验二小鼠股骨节段性缺损模型的构建及支架-细胞复合体的制作目的：探索小鼠股骨节段性缺损模型的自行修复能力,确定在5周观察期下小鼠股骨节段性缺损所需长度；制作壳聚糖/β-磷酸三钙支架；向支架接种种子细胞形成细胞-支架复合物并验证接种效果。方法：使用定制的专用内固定夹板和螺钉构建小鼠股骨节段性缺损模型；使用MicroCT和组织切片染色评价1.2mm缺损在5周时愈合状态；用冻干法制作壳聚糖/β-磷酸三钙支架；用浸泡离心法接种种子细胞形成细胞-支架复合体；冷冻切片后荧光染色观察种子细胞在支架内的分布。结果：MicroCT和组织切片染色结果显示1.2mm缺损在5周时未发生明显愈合,也没有明显新骨形成；荧光染色显示种子细胞在支架孔壁上黏附排列,在整个支架内部分布均匀。结论：在5周观察期条件下,由于仍未有自发的愈合,1.2mm节段性缺损可以用于研究骨缺损修复。用浸泡离心法向壳聚糖/β-磷酸三钙支架接种种子细胞效果符合预期,可以用于进一步实验。实验三慢病毒转染过表达CTGF的MC3T3-E1细胞在体内修复小鼠股骨节段性缺损的研究目的：在体内模型上研究过表达CTGF的MC3T3-E1细胞对小鼠股骨节段性缺损的修复效果。方法：使用定制的专用内固定夹板和螺钉构建1.2mm长度小鼠股骨节段性缺损；用冻干法制作壳聚糖/β-磷酸三钙支架；用浸泡离心法接种种子细胞形成细胞-支架复合体；将细胞-支架复合体植入修复小鼠股骨节段性缺损；观察2周、5周后取标本,用MicroCT分析各组愈合状态；组织切片染色分析标本骨组织学状态。结果：MicroCT三维重建图像显示在5周时支架-CTGF过表达细胞组明显优于另外两组,但是在2周时三组区别不明显,没有统计学差异。设定缺损区域为VOI定量分析发现CTGF过表达细胞组缺损区骨矿化密度(BMD)、骨量/组织量(BV/TV)、骨小梁数目(Tb.N)和连接密度(Conn.D)等指标明显比另外两组更高,有统计学意义,而骨小梁离散度Tb.Sp低于另外两组。这些结果表明过表达组骨愈合更好。同时,加细胞组与空白对照组相比,前者骨愈合各项指标都优于后者,表明载有细胞的支架修复效果好于空白支架。定量分析数据中,2周时所有组的各项数据都接近于0,没有明显差异,表明在两周时各组都未见明显的骨再生。骨小梁厚度Tb.Th在所有组中都没有明显差异。Manson’s三色染色结果显示在2周时,过表达细胞组缺损处已经出现了类骨质及骨改建过程,但在对照组中只看到细胞在支架中聚集,而在空白支架组中,只看到支架结构,未见细胞聚集。在5周时,过表达细胞组缺损已经有骨桥相连,几近愈合,对照组中仍然只有类骨质形成,空白对照组中仍然没有愈合,只能看到少量骨质改建。结论：过表达CTGF能在体内实验中促进骨的形成,CTGF过表达的细胞能够作为一种有效的种子细胞用于骨组织工程修复。综上所述,利用慢病毒在MC3T3-E1细胞中过表达CTGF后,细胞系能够过表达CTGF蛋白。在成骨诱导培养条件下,细胞系的成骨向分化各项指标都表现为上升,证明CTGF的过表达促进MC3T3-E1细胞的成骨向分化。同时过表达CTGF也增强了MC3T3-E1细胞的迁移能力,但对其增殖能力没有明显影响。以这种过表达CTGF的MC3T3-E1细胞作为种子细胞,用壳聚糖-p磷酸三钙支架搭载后,能够在体内模型上促进小鼠股骨节段性缺损的修复,故能作为一种有潜力的种子细胞用于骨组织工程。