前言铝（aluminum）是地壳中含量最丰富的元素之一,大量蓄积可产生神经毒性作用。国内外流行病学调查研究表明,铝易致神经元损伤,引起智力和认知能力下降等学习和记忆方面的缺欠。目前动物实验已证实,铝暴露可致大鼠痴呆,其不仅表现为学习、记忆的行为障碍,而且其病理形态学改变也与阿尔茨海默病（AD）相似。海马是学习和记忆的关键脑区,海马长时程增强（long-term potentiation,LTP）是NMDA（N-Methyl-D-Aspartate,N-甲基-D-门冬氨酸）受体依赖性突触传递效能的持续性增强,是公认的脑学习和记忆功能在突触水平的研究模型和细胞基础。因此研究铝暴露对LTP及与其突触机制有关的各项生化指标的影响,有助于从突触和蛋白分子水平阐明铝损害脑学习和记忆功能的作用机制。目前虽然铝对LTP损害作用的观察很多,但铝对LTP损害作用的突触机制尚未完全阐明。断乳后发育期是脑发育和逐渐完善的重要阶段,有关此阶段铝对学习和记忆及LTP影响的报道很少,因此我们应该对铝的直接发育毒性给予特别关注。且文献检索显示,铝对钙调神经磷酸酶（calcineurin,CaN）和蛋白激酶A（cAMP-dependentprotein kinase A,PKA）的直接影响尚未见报道。本实验以断乳后发育期慢性铝暴露大鼠为模型,观察铝对断乳后脑发育期的大鼠的直接发育毒性所致的学习和记忆能力、LTP诱导与维持的改变及对海马细胞内CaN、PKA表达的影响,进一步探讨铝对学习与记忆的影响及其突触机制,为铝所致儿童智力和认知能力低下性神经疾病的早期防治提供重要的实验依据。材料与方法1、动物分组与染毒断乳的（生后16天）健康Wistar大鼠90只（由中国医科大学实验动物中心提供）,体重90-120g,♀∶♂为1∶1。适应饲养环境1wk后,按体重随机分为3组:对照组（control group）:饮用蒸馏水;低剂量组（0.2%-Al group）和高剂量组（0.4%-Algroup）分别饮用浓度为0.2g/100ml和0.4g/100ml的AlCl₃水溶液。每组鼠30只,在饲料相同条件下,通过自由饮水对各组动物进行染毒,连续染毒3个月。然后,各组分批交替进行各项测试实验。动物室温度控制在18℃-23℃,相对湿度45%-55%,光照时间12h∶12h。2、学习和记忆的行为学测定采用跳台法即步下实验（step-down test）。学习行为训练:将大鼠放入跳台仪内适应3 min后,训练其找到平台三次。当大鼠跳下平台时,立即通电给予持续电刺激（36 v）并开始计时,记录5min内大鼠受到电刺激第一次跳上平台躲避电击的反应时间（escape latency,EL）以及受到电击的次数（number of errors）。记忆保持测试:24 h后,按原来的次序将大鼠依次放在平台上并通电,记录大鼠第1次跳下平台的时间（step-down latency,SDL）和5min内大鼠跳下平台受到电击的次数（number of errors）。3、电生理LTP测定乌拉坦麻醉后,将动物头部固定于脑立体定位仪上,暴露颅骨,在CA3区锥体细胞的Schaffer侧枝部位（坐标:前囟后3.3mm;旁开3.8mm;皮层下3.8mm）插入刺激电极。将内充3 mol/L KCl的记录玻璃微电极插入海马CA1区部位（坐标:前囟后3.3mm;旁开1.5mm;电极尖端先抵皮层表面,然后逐步推进）行细胞外记录。找到稳定的群体锋电位（population spike,PS）后,首先记录30min,每分钟给予一次单脉冲刺激（强度15～25 V,波宽0.2 ms的单一方波）,记录所诱发的PS。然后观察给予同样强度及波宽的的短串高频条件（100 HZ、持续5 s）刺激后,每分钟给予一次单脉冲检验刺激所诱发的PS的幅值变化,共记录45 min。4、海马钙调神经磷酸酶（CaN）的表达电生理测试后的大鼠,立即断头取脑,分离并取出双侧海马组织,按体积比为1∶3-1∶5放到预冷的裂解缓冲液中。4℃超声粉碎后,12 000r/min离心1 h,取上清分装。按照常规Western blot方法分离蛋白质。将蛋白印迹显影图用MultiGauge图像分析软件对实验结果（测定目标条带/gapdh条带灰度值）进行分析。电生理测试后的大鼠,4%多聚甲醛固定液心脏灌流固定。常规石蜡切片制作,用免疫组织化学的方法测定海马CaN阳性细胞的表达。用Metamorph/Evolution/BX51显微图像分析系统进行图像分析。5、海马蛋白激酶A（PKA）的表达电生理测试后的大鼠,立即断头取脑,分离并取出双侧海马组织,按体积比为1∶3-1∶5放到预冷的裂解缓冲液中。4℃超声粉碎后,12 000r/min离心1 h,取上清分装。按照常规Western blot方法分离蛋白质。将蛋白印迹显影图用MultiGauge图像分析软件对实验结果（测定目标条带/gapdh条带灰度值）进行分析。6、脑组织及血液中铝含量测定准确称取0.1～0.5g的脑组织和准确吸取0.2～0.5ml的全血于石英烧杯中,加5～8ml混酸,同时做空白对照。采用原子吸收石墨炉法测定脑铝和血铝含量。7、统计学处理实验所得数据资料用（?）±s表示,组间资料统计用（SPSS软件）单因素方差分析（ANOVA）检验,行为学数据不服从正态分布,采用秩和检验。实验结果1、各组大鼠学习和记忆行为学的比较与对照组相比,两个铝暴露组大鼠第一次跳上平台的时间（反应时间）均明显延长（P＜0.01）,跳下平台的潜伏期明显缩短（P＜0.01）,5 min内错误次数显著增加（P＜0.01）,且两铝暴露组间差异亦有显著意义（P＜0.01或P＜0.05）。2、各组大鼠PS幅值变化（即LTP增强率）的比较随着铝暴露剂量的增加,高频刺激后PS幅值平均增强率降低,其中低剂量组与对照组相比虽有差异,但无显著意义,而高剂量组与对照组相比,则明显降低且差异有显著意义（P＜0.05）。3、各组大鼠海马CaN表达的比较Western blot方法和免疫组织化学的方法的实验结果一致:与对照组相比,各铝暴露组海马CaN表达均显著增加,且两暴露组组间差异也有显著意义（P＜0.01）。4、各组大鼠海马PKA表达的比较随着铝暴露剂量的升高,PKA表达降低。与对照组相比,各铝暴露组海马内PKA表达均显著降低（P＜0.01）,且两铝暴露组组间差异有显著意义（P＜0.01）。5、各组大鼠血铝和脑铝含量的比较随着铝暴露剂量的升高,大鼠的血铝、脑铝含量逐渐升高,高剂量组的血铝含量明显高于对照组和低剂量组（P＜0.01或P＜0.05）;两铝暴露组的脑铝含量均明显高于对照组,且两暴露组组间的差异也有统计学意义（P＜0.01或P＜0.05）。讨论断乳后发育期的脑功能受损的研究是一个关系到婴幼儿智力健康发育的重要问题,同时,研究慢性铝暴露对此阶段脑发育的影响及其机制,对预防铝所致神经性疾病有着重要意义。本实验观察到,断乳后发育期慢性铝暴露的各组大鼠脑铝及血铝含量均显著升高。与对照组相比,两铝暴露组的学习和记忆能力及LTP诱导与维持均明显下降,表明断乳后的铝暴露,可通过血脑屏障进入大鼠体内,造成铝在体内蓄积,特别是脑内的蓄积,进而损害了大鼠的学习和记忆能力。本实验还观察到,各组海马细胞内CaN表达明显升高,同时各组海马细胞内PKA表达明显降低,提示,断乳后慢性铝暴露大鼠学习和记忆能力的减退的可能原因之一是铝刺激了CaN的表达,另一方面原因可能是铝干扰了PKA的表达。就我们所涉猎的文献显示,铝可干扰谷氨酸（glutamate,Glu）能神经传递、NMDA受体相关的信号转导途径,铝可抑制参与胞内钙信号调节的多种分子途径,铝可降低小脑内钙调蛋白（calmodulin,CaM）的含量,铝还可使胆碱能和去甲肾上腺素能神经传递发生改变。可见,铝损伤了LTP诱导中的一系列环节,使Glu、NMDA受体、Ca²⁺与CaM均减少,必然影响其下游过程。铝可增加CaN的表达,还能使其活性增加;此外,铝可抑制PKA的表达,也可通过降低Ca²⁺浓度及CaM使PKA激活减少,进而干扰了关键突触分子的磷酸化激活过程。铝通过上述途径导致LTP的诱导和维持受阻,致使大鼠学习和记忆能力下降。总之,铝可损害LTP诱导中的多种突触机制,从而损害大鼠的学习和记忆能力。结论1、断乳后慢性铝暴露使大鼠学习测试的反应时间显著延长,记忆测试的潜伏期明显缩短,五分钟错误次数均显著增加,提示铝暴露损害了大鼠的学习和记忆行为。2、断乳后慢性铝暴露使大鼠随着铝暴露剂量的增加,PS幅值平均增强率减小,铝暴露组的LTP发生率逐渐下降,LTD发生率逐渐增加,提示铝暴露损害了大鼠LTP的诱导与维持。3、断乳后慢性铝暴露使大鼠海马细胞内CaN表达增加,提示这可能是铝损害LTP的突触机制之一。4、断乳后慢性铝暴露使大鼠海马细胞内PKA表达减少,可能是铝损害LTP的另一突触机制。