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恶性肿瘤是危害人们生命健康的重大疾病,尽管肿瘤的治疗有了一定的进展,但是抗肿瘤药物的研发还是任重而道远。在超过50%的肿瘤患者中存在p53基因的突变,p53基因突变后获得功能而变成癌基因可促进肿瘤的发生和发展。目前证实了突变p53可作为抗肿瘤药物的靶点,其中采用小分子化合物使mutp53恢复野生型功能是一研究的热点。紫铆因（Butein）属于黄多酚类物质,具有消炎、抑菌、抗病毒、抗肿瘤、保护心血管系统、保护肝肾、清除自由基等多重生物学功能,但在靶向mutp53发挥抗肿瘤方面,至今尚未有人报道。我们前期构建了PUMA promoter荧光素酶报告载体质粒。并将PUMA promoter荧光素酶报告载体转染到H1299-p53R273H和H1299-R175H的细胞中,得到可以筛选mutp53重激活剂的细胞株,并通过此系统筛选了一系列的天然化合物,发现Butein可能具有恢复突变p53R273H和p53R175H的功能而激活PUMA表达。基于此,本研究进一步验证了Butein对mutp53的重激活作用,初步探究化合物Butein潜在的恢复p53功能的作用机理。我们首先探究了Butein对于p53R273H、p53R175H构象的影响。采用构象特异性p53抗体PAb1620（识别野生型构象）、PAb240（识别突变型构象）进行免疫荧光和免疫沉淀实验,发现Butein处理后,HT29(p53R273H)、SK-BR-3(p53R175H)细胞中mutp53的表达出现了明显下降,而wtp53的表达显著上升,说明Butein可以恢复p53R273H、p53R175H的野生型构象。由于p53的DNA结合活性及转录功能与其构象密切相关,p53在发生突变后,会失去p53DNA结合能力,进而会导致转录激活功能缺失。因此,我们采用凝胶阻滞实验检测了p53R273H、p53R175H的DNA结合活性的恢复。结果显示Butein处理后,HT29(p53R273H)、SK-BR-3(p53R175H)细胞中与p53特异性结合的DNA量增多,说明Butein可以恢复p53R273H、p53R175H的DNA结合活性。接着我们探究了Butein是否进一步恢复p53R273H、p53R175H的转录活性。通过染色质免疫共沉淀检测,发现Butein处理后,HT29(p53R273H)、SK-BR-3(p53R175H)细胞中p53与PUMA启动子结合增强;此外,Butein可上调HT29(p53R273H)、SK-BR-3(p53R175H)细胞中PUMA、NOXA等p53靶基因的m RNA及蛋白水平,说明Butein可以恢复p53R273H、p53R175H的转录激活功能。另外,我们进一步探究了Butein上调p53靶基因是否由mutp53重激活引起。经过RNA干扰p53及联合p53转录抑制剂PFT-α抑制HT29(p53R273H)、SK-BR-3(p53R175H)细胞中p53后,发现Butein对于p53靶基因的上调作用受到明显抑制,说明Butein通过重激活mutp53而上调p53靶基因的表达水平。此外,p53的同源家族TAp63、TAp73,同样可以激活p53的转录功能;因此,采用RNA干扰TAp73。结果显示,在SK-BR-3细胞中,Butein对于p53靶基因的上调作用并没有受到影响。说明Butein上调p53靶基因并不依赖于TAp73.进一步,我们探究Butein重激活mutp53潜在的分子机制。鉴于分子伴侣对mutp53构象及活性变化的关键作用,即分子伴侣Hsp90/Hsp70/Hsp40可以与mutp53形成稳定的复合物,使mutp53得以稳定,抑制CHIP、MDM2对mutp53的泛素化降解。我们首先探究了分子伴侣Hsp90、Hsp70在Butein重塑mutp53野生型构象及功能过程中的潜在影响,结果显示:Butein处理HT29、SK-BR-3细胞后,Hsp90与mutp53的相互作用减弱;Hsp90乙酰化增加,但是Hsp90ATPase活性没有改变;此外,由于Hsp90对mutp53稳定性和构象起关键作用,我们进一步在外源过表达Hsp90后,Butein处理HT29、SK-BR-3细胞后,结果显示,Butein降低mutp53的表达,增加wtp53的表达,以及p53靶基因的上调明显受到抑制。说明Butein可能通过调控Hsp90的活性来影响mutp53的野生型功能。此外,由于细胞的氧化还原状态与p53构象有关,wtp53序列DNA的结合能力发挥依赖于还原性的环境,我们还检测了Butein是否可以诱导氧化应激进而抑制肿瘤,采用Butein（10、20μM）处理HT29(p53R273H)、SK-BR-3(p53R175H)肿瘤细胞3、6、12h后,ROS分别增加了1.5、5.8倍,说明Butein可以诱导氧化应激。此外,p53的DBD中含有10个Cys,其中Cys182、Cys229、Cys242、Cys227位于p53核心结构表面,在p53发生突变后,就会使Cys暴露出来,更容易受到巯基共价修饰。而Butein是α、β不饱和酮,具有活性双键,因此可能发生巯基共价修饰。我们进一步检测了氧化还原平衡以及巯基修饰对Butein重激活mutp53转录功能的影响,采用了DTNB实验,检测了Butein与巯基之间的反应,结果显示,在Butein与NAC共孵育1h后,发现Butein具有巯基结合活性;此外,Butein（10、20μM）联合NAC共同处理HT29(p53R273H)、SK-BR-3(p53R175H)细胞48h结果显示,Butein恢复p53转录激活功能,以及降低mutp53的表达,增加wtp53的表达的作用明显被逆转。说明了Butein可能通过共价修饰直接与mutp53发生作用,从而重激活mutp53的野生型功能。综上所述,我们研究发现Butein可以恢复DNA接触突变体p53R273H和构象突变体p53R175H的野生型构象和DNA结合活性、转录激活功能,并且可能通过调控Hsp90的活性来影响mutp53的野生型构象;此外Butein通过巯基共价修饰来重激活mutp53的野生型功能。此课题为Butein靶向突变p53的抗肿瘤作用具有一定的指导意义。