LINE-1 5'非编码序列(5'-UTR)在HepG2细胞中的功能研究

来源 :北京交通大学 | 被引量 : 1次 | 上传用户:czqmip
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目的:研究LINE-1逆转座子非编码序列5’-UTR(5’-untranslated region)在肿瘤细胞中的作用机制。  方法:采用常规分子克隆技术将不同长度的5’-UTR序列(400bp、680bp、全长903bp)构建到荧光素酶载体pCBG99-control上,然后将其转染到人肝癌细胞HepG2细胞中,通过荧光素酶报告基因的表达研究其具有的双向启动子的活性,并通过构建不同长度的突变体比较其结构对活性的影响;基于我们的发现,我们分析了启动子不同活性的结构基础,并对差异区域可能生成的miRNA761进行了进一步研究,通过共转染HepG2细胞,观察microRNA761对报告基因荧光素酶的表达的影响。为进一步探索LINE-1序列中的5’-UTR的作用机制以及可能与L1-ORF1p之间的关系,我们通过共同转染,检测转染细胞基因组中L1-5’UTR的甲基化和组蛋白乙酰化的变化;另外,由于L1-ORF1p与。RISC(RNA诱导沉默复合体)珍惜爱细胞中有共定位现象,我们推测L1-ORF1p可能与RISC中的重要组分存在相互作用,为此我们通过免疫共沉淀技术检测ORF-1p和AGO2蛋白之间是否形成蛋白复合体。  结果:正向不同长度的5’-UTR序列均具有启动子的活性,且680bp的5’-UTR活性最大,与pCBG99-congol报告基因表达载体巾的SV40启动子活性相当,全长次之,400bp长度的活性最低;反向5’-UTR序列的启动子活性低于正向;重组载体和microRNA761共转染结果显示,microRNA761在5’-UTR序列负反馈的调控中没有发挥作用。L1-ORF1p对5’-UTR序列有抑制作用,这种抑制作用不是通过基因组的甲基化,而可能是通过影响乙酰化组蛋白的分布方式调控的,其作用机制需要进一步的探索;另外,ORF-1p与AGO2蛋白之间存在相互作用,从而可能对AGO2的活性造成影响。  结论:5’-UTR序列具有启动予活性,且不同长度的序列,其正义链启动子活性在保留其5‘端680bp时最强,提示5‘UTR全长在3’端存在对其活性抑制的区域,反义链启动子有一定的活性,强度约为正向启动子的八分之一。ORF-1p对LINE-1的5’-UTR的抑制是通过两种方式调控的,一是通过乙酰化组蛋白的分布方式,二是可能通过与AGO2蛋白之间的相互作用,影响了miRNA或siRNA的加工生成。这些具体的机制还未见报道,对了解肿瘤发生、发展和调控的分子机理以及肿瘤药物靶标具有重要意义。
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