子痫前期(preeclampsia, PE)是妊娠期特有的疾病,发生率高达8%,常伴有严重的母婴并发症,直接造成全世界每年6-7万孕妇死亡,16%胎儿宫内死亡。发病于34周前的重度子痫前期称为早发型重度子痫前期(early onset severe preeclampsia, ES-PE),发病越早,预后越差。34周后发病者称为晚发型重度子痫前期(late-onset severe preeclampsia, LS-PE),胎儿接近或达到成熟。其发病机理迄今尚未完全阐明,如何进一步探索重度子痫前期的发病机制,对重度子痫前期进行预防、监测,以最大限度降低其危险性,成为世界范围内临床医师关注的热点。重度子痫前期的发病机制涉及遗传、免疫、氧化应急等多种因素,多年来的研究认为该病起源于胎盘,重度子痫前期胎盘形成过程中,母体和胎盘间免疫耐受发生改变导致子宫螺旋小动脉生理重铸过程障碍,胎盘血流灌注减少,胎盘缺血缺氧,释放细胞毒性物质,通过血液循环播散到全身,导致全身不同程度的血管内皮损伤,引起小动脉痉挛。另外,胎盘应激状态下各种细胞因子的释放,免疫耐受等因素,更加重了胎盘组织的缺氧状态,对胎盘自身也造成极大的损害,细胞出现表面微绒毛的丧失,使物质交换的面积减少,严重影响胎盘的物质交换,导致胎盘功能下降,认为胎盘形态学变化与该病的发生、发展和预后密切相关。目前的研究对早发型与晚发型重度子痫前期的发病机制存在争议。早发型重度子痫前期胎盘的合体滋养细胞凋亡早且严重,说明早发型和晚发型重度子痫前期两者可能存在不同的病因和发病机制。但是引起胎盘发生病理生理改变的机理并不清楚。代谢组学(metabonomics)是继基因组学、蛋白质组学、转录组学后出现的新兴组学,它通过定量测量生物体受病理生理刺激和基因修饰所产生的与时间相关的多元代谢产物,跟踪其代谢路径。代谢组学的出现是生命科学研究的必然,代谢产物是基因表达的最终产物,其水平是由代谢途径中所有酶的活性及作用于这些酶的效应物决定的,与机体的生理、病理、发育状态有关。因此,代谢组学提供了从另一角度研究疾病的方法。代谢足迹技术(metabolic footprint)是在分析系统中以培养基为介质,监控细胞从生长培养基中消耗营养物以及分泌代谢物至培养基的全部过程,检测由细胞和组织分泌的代谢产物或从环境中吸收代谢物的定性和半定量的分析方法。代谢组学的研究方法已经成功应用于子痫前期孕妇的血清和胎盘的研究,为预测疾病和了解疾病的发病机制提供了新的研究手段。研究代谢组学的技术发展迅速,液相色谱-质谱(LC-MS)将具有高效、快速分离效能的液相色谱与灵敏、准确的质谱或多级质谱的结合,广泛应用于难挥发性化合物、极性化合物、热不稳定化合物和大分子化合物(包括蛋白质、多肽、多糖、多聚物等)的分析,可进行定性和定量分析,是最具前途的代谢组学研究技术之一。液相色谱能减少离子抑制效应,根据同分异构体物理化学性质选择合适的色谱分离条件可以使分析对象得到很好的分离,合适的液相色谱分离方法可以获得更低检测限,并可以降低背景噪音,获得更高质量质谱数据。目前可对比查询的色谱库较少,我们可以使用标准品,自己建库并解析谱图,依靠与标准物对比来判断未知代谢物。人类妊娠中支持胎儿的生长发育需要提供足够的氨基酸,在子宫胎盘的转运、吸收及代谢保持平衡状态非常重要,各种氨基酸种类不同,代谢也不同。谷氨酸(glutamate, Glu)和谷氨酰胺(glutamine, Gln)是在胎盘和胎儿肝脏之间的转换,这种转换方式持续了整个妊娠期。提供给胎儿的谷氨酰胺主要是通过子宫的吸收转运和胎盘自主产生。胎儿肝脏摄取谷氨酰胺,转换成谷氨酸,再供应给胎盘组织。通过血流灌注,90%的谷氨酸被胎盘组织摄取。胎盘谷氨酸的摄取,结合胎盘自身生产氨基酸,通过支链氨基酸转移,完成妊娠期间谷氨酰胺/谷氨酸的内循环。色氨酸(tryptophan, Trp)是细胞维持活化和增殖所必需的氨基酸,同时也是构成蛋白质必不可少的重要成分,参与机体多种病理生理过程。在哺乳动物中,摄入的色氨酸绝大多数经犬尿氨酸(kynurenine, Kyn)代谢途径代谢,即色氨酸在吲哚胺-2,3-双加氧酶(indoleamine-2,3-dioxygenase, IDO)的催化下合成重要的中间代谢产物犬尿氨酸。吲哚胺-2,3-双加氧酶是肝外组织催化色氨酸沿犬尿氨酸途径分解代谢的第一限速酶,其广泛表达于母胎界面,在滋养层和胎盘中均存在吲哚胺2,3-双加氧酶,其表达随着健康孕妇胎盘的发育而增强,因此正常妊娠时孕妇血中色氨酸含量降低,而犬尿氨酸含量升高,吲哚胺-2,3-双加氧酶在抗炎及诱导母胎免疫耐受中发挥着重要的调节作用。这四种氨基酸对人类母体胎盘组织的病理生理变化有至关重要的作用,而且几种氨基酸浓度的改变与子痫前期的发病机制相关。本研究采用代谢足迹技术,选择早发型、晚发型重度子痫前期和正常妊娠孕妇,在孕妇结束妊娠20分钟内,取胎盘绒毛组织,分别在1%及6%氧浓度的血清培养基中37℃温度下培养,通过高效液相色谱-质谱(HPLC-MS)分析比较六组标本在培养基中的代谢产物,来了解缺氧在重度子痫前期发病机制中的作用,探讨早发型和晚发型重度子痫前期发病机制的不同,探索在缺氧条件下重度子痫前期绒毛组织产生的未知的代谢产物,同时使用标准品,建立谷氨酸、谷氨酰胺、色氨酸及犬尿氨酸色谱图库,通过分析不同氧浓度下培养的胎盘绒毛组织在培养液中的氨基酸浓度,来研究谷氨酸、谷氨酰胺、色氨酸及犬尿氨酸在重度子痫前期发病机制中的作用,对将来重度子痫前期的预测、早期干预和治疗提供靶点,降低其发病率,减少母婴并发症,降低孕产妇和围产儿死亡率。第一章低氧条件下重度子痫前期患者胎盘绒毛组织代谢足迹的变化[目的]利用代谢组学中代谢足迹技术的方法,通过观察1%及6%氧浓度下培养的正常妊娠组、早发型及晚发型重度子痫组胎盘绒毛组织在培养液中的代谢产物,来研究缺氧在重度子痫前期发病机制中的作用,探讨早发型和晚发型重度子痫前期发病机制的不同,并了解在缺氧条件下其胎盘绒毛组织在培养液中产生的未知的代谢产物。[方法]1胎盘绒毛组织的培养：选择正常妊娠组(27例)、早发型重度子痫前期组(13例)及晚发型重度子痫前期组(14例)的孕妇,在孕妇结束妊娠20分钟内,取胎盘绒毛组织,分别在1%及6%氧浓度的血清培养基中37℃温度下培养,48小时后换培养液,再培养48小时,将培养液离心处理后,取上清于-80℃冰箱冻存。2培养液样品的预处理：培养液样品室温下解冻摇匀,吸取100μL培养液样品于离心管中,加入300μL甲醇沉淀蛋白,涡旋混匀1分钟,使用冷冻高速离心机,在4℃的条件下,12000转离心15分钟,吸取上清液经水系针头过滤器过滤。取过滤后样品120μL置于96孔板,待用HPLC-MS分析。3高效液相色谱-质谱(HPLC-MS)分析：分别设置液相色谱、质谱条件及其工作模式,自动加样。4数据统计方法：原始的LC-MS数据文件,导入the MarkerViewTM软件进行数据的提取及前处理,采用主成分分析(PCA)的方法来观察各组样本间的总体的分布状况。然后用主成分判别分析法(PCA-DA)来鉴别各组间代谢轮廓贡献较大的代谢物,找到与重度子痫前期最相关的差异代谢物。在MarkerViewTM软件包中对相关的差异代谢物行T检验。不同部位胎盘绒毛组织代谢足迹变化的数据导入EXCEL文档,应用SPSS13.0软件进行方差分析。[结果]11%氧浓度下培养的正常妊娠组、6%氧浓度下培养的正常妊娠组、1%氧浓度下培养的重度子痫前期组、6%氧浓度下培养的重度子痫前期组分别取自胎盘边缘,中间,近脐带三点处胎盘绒毛组织代谢足迹的比较差异无显著性意义(P>0.05)。从而表明同一个胎盘取自不同的部位代谢足迹的变化差异无显著性意义,可以看成是本实验数据分析的重复。21%氧浓度与6%氧浓度下培养的正常妊娠组胎盘绒毛组织代谢足迹中545个代谢物差异有统计学意义(P<0.05)；6%氧浓度下正常妊娠组与6%氧浓度下早发型重度子痫前期组的代谢足迹中291个代谢物差异有统计学意义(P<0.05)；6%氧浓度下早发型重度子痫前期组与6%氧浓度下晚发型重度子痫前期组胎盘绒毛组织代谢足迹中36个代谢物差异有统计学意义(P<0.05)；1%氧浓度下重度子痫前期组与6%氧浓度下培养的正常妊娠组胎盘绒毛组织代谢足迹中528个代谢物有差异有统计学意义(P<0.05)。选择两组间差异较大的一种代谢物,在Analyst软件中提取特征离子(XIC)色谱图及增强型全扫描(EMS)色谱图,MarkerViewTM软件中输出增强性产物离子扫描(EPI)色谱图。3 PCA分析结果表明,1%氧浓度下正常妊娠组的代谢足迹与6%氧浓度下晚发型重度子痫前期组的代谢足迹差异无统计学意义；1%氧浓度下正常妊娠组的代谢足迹与6%氧浓度下早发型重度子痫前期组的代谢足迹差异无统计学意义；1%氧浓度下早发型重度子痫前期组与6%氧浓度下晚发型重度子痫前期组的代谢足迹差异无统计学意义；1%氧浓度下培养的正常妊娠组与6%氧浓度下培养的重度子痫前期组胎盘绒毛组织代谢足迹差异无统计学意义；6%氧浓度下正常妊娠组的代谢足迹与6%氧浓度下晚发型重度子痫前期组的代谢足迹差异无统计学意义。[结论]利用HPLC-MS技术的代谢组学方法,能测定在不同氧浓度下培养的正常妊娠组和重度子痫前期组胎盘绒毛组织代谢足迹的变化,表明该方法适合于重度子痫前期的代谢组学研究。检测到早发型和晚发型重度子痫前期组胎盘绒毛组织代谢足迹的变化有差异,表明早发型和晚发型重度子痫前期发病机制可能不同。检测到在不同氧浓度下培养的正常妊娠组、早发型和晚发型重度子痫前期组胎盘绒毛组织代谢足迹变化的差异变量,并对有差异的代谢物进行增强型全扫描(EMS)及增强性子离子扫描(EPI),提供了大量代谢物结构上的信息,将来可以进一步鉴定代谢物名称并对其深入研究。第二章低氧条件下谷氨酸、谷氨酰胺、色氨酸及犬尿氨酸在重度子痫前期患者胎盘绒毛组织中代谢的变化[目的]应用高效液相色谱-质谱(HPLC-MS)技术,使用标准品,建立谷氨酸、谷氨酰胺、色氨酸及犬尿氨酸色谱图库,通过分析1%及6%氧浓度下培养的正常妊娠组、早发型及晚发型重度子痫组胎盘绒毛组织在培养液中的氨基酸浓度,来研究谷氨酸、谷氨酰胺、色氨酸及犬尿氨酸在重度子痫前期发病机制中的作用及其相关的代谢通路。[方法]1胎盘绒毛组织培养液分组：选择正常妊娠组(22例)、早发型重度子痫前期组(12例)及晚发型重度子痫前期组(14例)的胎盘绒毛组织培养液。2培养液样品的预处理：如第一章所示。3标准品色普图库的建立：取标准品(谷氨酸、谷氨酰胺、犬尿氨酸、色氨酸)用色谱纯甲醇配制标准溶液,分别用HPLC-MS检测。我们先将四种标准溶液逐一检测,根据其分子量确定实验条件,再将四种标准溶液混合后取100ul用HPLC-MS检测,建立色谱图库。4高效液相色谱-质谱(HPLC-MS)分析：分别设置液相色谱、质谱条件及其工作模式,自动加样。5数据统计方法：原始的LC-MS数据文件,导入Analyst软件进行数据的提取及前处理,提取的数据导入EXCEL文档,根据计算公式：样品浓度(ug/ml)=样品峰面积×标准品浓度/标准品峰面积,计算出每个样品的浓度,应用SPSS13.0软件进行T检验及Mann-Whitney检验。[结果]1与1%氧浓度下重度子痫前期比较：6%氧浓度下重度子痫前期组谷氨酸浓度升高有统计学意义,色氨酸浓度降低有显著性意义(P<0.01),犬尿氨酸浓度升高有显著性意义(P<0.01)；6%氧浓度下正常妊娠组色氨酸浓度降低有显著性意义(P<0.01),犬尿氨酸浓度升高有显著性意义(P<0.01)；1%氧浓度下正常妊娠组四种氨基酸浓度差异无统计学意义(P>0.05)。2与6%氧浓度下早发型重度子痫前期组比较：1%氧浓度下早发型重度子痫前期谷氨酸浓度降低有统计学意义(P<0.05),色氨酸浓度升高有显著性意义(P<0.01),犬尿氨酸浓度降低有显著性意义(P<0.01)；6%氧浓度下晚发型重度子痫前期组犬尿氨酸浓度降低有显著性意义(P<0.01)；1%氧浓度下晚发型重度子痫前期组谷氨酸浓度降低有显著性意义(P<0.01),色氨酸浓度升高有显著性意义(P<0.01),犬尿氨酸浓度降低有显著性意义(P<0.01)；6%氧浓度下正常妊娠组犬尿氨酸浓度降低有显著性意义(P<0.01)；1%氧浓度下正常妊娠组谷氨酸浓度降低有统计学意义(P<0.05),色氨酸浓度升高有显著性意义(P<0.01),犬尿氨酸浓度降低有显著性意义(P<0.01)。3与1%氧浓度下正常妊娠组比较：6%氧浓度下正常妊娠组色氨酸浓度降低有显著性意义(P<0.01),犬尿氨酸浓度升高有显著性意义(P<0.01)；1%氧浓度下晚发型重度子痫前期组四种氨基酸浓度差异无统计学意义(P>0.05)；6%氧浓度下晚发型重度子痫前期组色氨酸浓度降低有显著性意义(P<0.01),犬尿氨酸浓度升高有显著性意义(P<0.01)；1%氧浓度下早发型重度子痫前期组四种氨基酸浓度差异无统计学意义(P>0.05)。4与6%氧浓度下正常妊娠组比较：6%氧浓度下晚发型重度子痫前期组四种氨基酸浓度差异无统计学意义(P>0.05)；1%氧浓度下早发型重度子痫前期组色氨酸浓度升高有显著性意义(P<0.01),犬尿氨酸浓度降低有显著性意义(P<0.01)；1%氧浓度下晚发型重度子痫前期组色氨酸浓度升高有显著性意义(P<0.01),犬尿氨酸浓度降低有显著性意义(P<0.01)。5与6%氧浓度下晚发型重度子痫前期组比较：1%氧浓度下早发型重度子痫前期组色氨酸浓度升高有显著性意义(P<0.01),犬尿氨酸浓度降低有显著性意义(P<0.01)；1%氧浓度下晚发型重度子痫前期组色氨酸浓度升高有显著性意义(P<0.01),犬尿氨酸浓度降低有显著性意义(P<0.01)。[结论]本实验应用的标准品法建立色谱图库HPLC-MS分析的胎盘绒毛组织培养液的代谢组学方法稳定可靠,可以用于重度子痫前期的代谢通路的研究。研究发现在低氧状态下正常妊娠组及重度子痫前期组的谷氨酸、色氨酸及犬尿氨酸代谢有显著变化,证明低氧在重度子痫前期的发病机制中起重要作用。发现色氨酸及犬尿氨酸在胎盘绒毛组织培养液浓度的变化符合代谢通路的规律,而且与重度子痫前期的发生关系密切,犬尿氨酸的浓度在早发型与晚发型重度子痫前期胎盘绒毛组织培养液中有显著差异,推测两者可能有不同的发病机制。全文结论1利用HPLC-MS技术的代谢组学方法,能测定在不同氧浓度下培养的正常妊娠组和重度子痫前期组胎盘绒毛组织代谢足迹的变化,表明该方法适合于重度子痫前期的代谢组学研究。2利用HPLC-MS技术的代谢组学方法,检测到早发型和晚发型重度子痫前期组胎盘绒毛组织代谢足迹的变化有差异,表明早发型和晚发型重度子痫前期发病机制可能不同。3利用HPLC-MS技术的代谢组学方法,检测到在不同氧浓度下培养的正常妊娠组、早发型和晚发型重度子痫前期组胎盘绒毛组织代谢足迹变化的差异变量,并对有差异的代谢物进行增强型全扫描(EMS)及增强性子离子扫描(EPI),提供了大量代谢物结构上的信息,将来可以进一步鉴定代谢物名称并对其深入研究。4本实验应用标准品法建立色谱图库HPLC-MS分析的胎盘绒毛组织培养液的代谢组学方法稳定可靠,可以用于重度子痫前期的代谢通路的研究。5利用胎盘绒毛组织培养液的代谢物标准品法的研究,能发现在低氧状态下正常妊娠组及重度子痫前期组的谷氨酸、色氨酸及犬尿氨酸代谢有显著变化,证明低氧在重度子痫前期的发病机制中起重要作用。6通过对胎盘绒毛组织培养液的谷氨酸、谷氨酰胺、色氨酸及犬尿氨酸的定性及定量研究,发现色氨酸及犬尿氨酸浓度的变化符合代谢通路的规律,而且与重度子痫前期的发生关系密切,犬尿氨酸的浓度在早发型与晚发型重度子痫前期胎盘绒毛组织培养液中有显著差异,推测两者可能有不同的发病机制。