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国兰,指兰科兰属中的部分地生种,包括墨兰、建兰、春兰、寒兰、蕙兰、莲瓣兰和春剑等,是极具特色的中国传统名花。FLOWERING LOCUS T(FT)基因是植物开花调控途径的整合基因,整合来自光周期途径、春化途径和自主途径等不同花发育途径的信号,在植物花发育中发挥着重要作用。为了解国兰花期调控的分子机理,本研究采用同源基因克隆的方法分别从墨兰品种‘企剑白墨’、春兰野生种、建兰品种‘金丝马尾’中克隆到FT基因,并对其表达特性及功能进行了初步研究。主要研究结果如下:
1.根据已知FT的同源基因设计引物,结合RT-PCR,RACE-PCR以及hiTAIL-PCR技术,从墨兰、春兰和建兰中克隆到FT基因,分别命名为CsFT、CgFT和CeFT(GenBank登录号分别为HM120862、HM120863和HM803115)。分离克隆到的FT基因cDNA全长序列均为618 bp,其中开放阅读框(ORF)为531bp,编码176个氨基酸。这三个基因的DNA序列均包含两个外显子和一个内含子,内含子大小均为161bp。.
2.氨基酸结构域分析显示,CsFT,CgFT和CeFT都具有PEBP家族的典型结构特征。氨基酸序列的同源性分析显示,这三个基因编码的氨基酸序列完全一致;与其他植物中FT基因的氨基酸序列有较高的同源性,其中与文心兰OnFT的同源性最高,为94%;与水稻Hd3a、拟南芥FT的同源性分别为79%和74%。
3.利用RT-PCR分析CeFT基因在建兰花发育不同阶段不同器官中的表达模式,结果表明:CeFT基因在各器官中均有表达,营养生长期CeFT基因在腋芽中的表达量最高,生殖生长期CeFT基因在腋芽,花梗,花蕾等器官中的表达量最高,假鳞茎中的表达量次之,在根和叶中的表达量最低。
4.为检测不同光周期下国兰FT的表达特征,将墨兰、春兰和建兰进行长日照处理30 d后转入短日照处理7d。Real-Time PCR技术分析结果表明,FT表达水平在长日和短日条件下都呈现明显昼夜节律。墨兰CsFT和春兰CgFT在短日条件下的表达量均显著高于长日条件下的表达量;建兰CeFT在长日和短日条件下的表达强度基本一致。
5.利用载体pBIl21,构建了35S::CgFT的超表达载体,采用农杆菌介导的花序浸染法将春兰CgFT基因转化到拟南芥哥伦比亚牛态型(Col)野生型植株中。通过与野牛型抽薹期、开花期以及对应的莲座叶数的比较,结果表明在拟南芥中超表达CgFT的促进开花效果显著。