黄曲霉毒素B1(aflatoxin B1,AFB1)是畜禽饲料中最常见的致癌污染物。肉鸡AFB1中毒事件频频发生,除了能影响肉鸡生长效率、繁殖力等,还会因其免疫抑制作用导致中毒鸡只对多种传染病易感性增强,加大其患病率和死亡率;同时,饲料中的AFB1及其代谢物可以蓄积在肉鸡的肝脏、肾脏和肌肉组织中,人食入后可引起慢性中毒甚至癌症,对畜牧业、公共卫生和人体健康威胁极大。目前关于AFB1致肉鸡亚慢性肝损伤的机制尚不完全明确。姜黄素是从姜科和天南星科植物根茎中提取的二酮类化合物,具有抗肿瘤、抗氧化、抗炎等作用。近期研究发现姜黄素在脂肪肝、肝炎、肝硬化、肝癌等疾病中具有肝保护作用,然而其对AFB1诱导的肉鸡亚慢性肝损伤的保护效果及其分子机制尚不明确。AA肉鸡是中国市场占有量最大的肉鸡品种。本研究以1日龄AA肉雏鸡为实验动物,建立AFB1亚慢性肝损伤模型并应用不同剂量姜黄素干预,采用DNA/RNA染色、透射电镜和Western Blot、Real Time-PCR等先进分子生物学技术,探讨AFB1亚慢性暴露对肉鸡肝脏细胞自噬、凋亡、炎症和增殖相关基因表达的影响以及TLR4/NF-κB通路在此过程中扮演的角色,探明姜黄素能否通过影响自噬、凋亡、炎症和增殖相关基因表达干预AFB1致肉鸡亚慢性肝损伤及其干预效果的可持续性。形态学和超微形态学检查结果:AFB1连续暴露28天,与空白对照组(C组)相比,透射电镜观察肝细胞超微结构发现,AFB1染毒组(A组)肝细胞自噬小体罕见,线粒体结构紊乱、嵴断裂,细胞核染色质边集化;采用姜黄素连续干预28天,低剂量姜黄素(L组)对上述病理改变干预效果不明显,中(M组)、高(H组)剂量姜黄素干预明显改善上述病理变化,H组肝细胞自噬小体重新出现,细胞核染色质分布均匀,线粒体结构清晰;姜黄素对照组(CC组)肝细胞超微结构未见异常。肝组织切片DNA/RNA染色及凋亡和坏死细胞计数结果显示,A组凋亡和坏死细胞数量显著增加(P<0.01),姜黄素干预能剂量依赖性减少凋亡、坏死细胞数(L、M、H组,P<0.01),CC组未见明显异常。停止暴露AFB1和姜黄素干预7天后,透射电镜观察发现,A组肝细胞自噬小体罕见,细胞核染色质聚集或边集,线粒体嵴结构不清,细胞间隙出现纤维样物质。其它各组中除L组肝细胞核仍有轻微的染色质聚集以外,各组肝细胞溶酶体活动性强,自噬现象明显,细胞核染色质分布均匀,线粒体结构清晰。DNA/RNA染色及凋亡和坏死细胞计数结果显示,A组凋亡和坏死细胞数明显多于C组(P<0.01),姜黄素干预组凋亡和坏死细胞数较A组剂量依赖性减少(P<0.01),CC组较C组无明显差异。说明姜黄素能有效干预AFB1亚慢性暴露诱发的肝细胞自噬抑制和凋亡、坏死增加,而且姜黄素的干预效果在停药7天内具有持续性。自噬相关蛋白、基因检测结果:AFB1连续暴露28天,与C组比较,A组肝脏LC3a蛋白表达、LC3b-II/LC3b-I比值和beclin-1 mRNA表达显著减少(P<0.01),m TOR蛋白、m RNA以及肝细胞质P53蛋白表达显著增加(P<0.01)。姜黄素连续干预28天,与A组比较,姜黄素干预组LC3a蛋白表达、LC3b-II/LC3b-I比值、beclin-1 m RNA表达明显增加(P<0.05或P<0.01),m TOR蛋白、m RNA以及细胞质P53蛋白表达量明显减少(P<0.05或P<0.01)。CC组与C组比较,LC3b-II/LC3b-I比值和beclin-1 m RNA表达水平升高(P<0.01)。停毒停药7天后,各组肝脏上述各指标变化趋势与28天相似,仅CC组各项指标与C组无统计学差异。说明姜黄素可能通过促进beclin-1表达、抑制mTOR和细胞质P53表达诱导LC3a和LC3b-II/LC3b-I水平增加进而干预AFB1亚慢性暴露引起的肝细胞自噬抑制,而且其干预作用在停药7天内具持续性。凋亡相关蛋白、基因检测结果:AFB1连续暴露28天,与C组比较,A组肝脏Caspase-3、Bax、细胞核P53蛋白、p53 m RNA、bcl-2 m RNA表达量显著增加(P<0.01)。姜黄素连续干预28天,与A组相比,姜黄素干预组bcl-2 m RNA表达剂量依赖性增加(P>0.05或P<0.01),其它各指标均呈剂量依赖性降低(P>0.05或P<0.05或P<0.01)。CC组较C组bcl-2 m RNA表达增加(P<0.01)。停毒停药7天后,与C组比较,A组除bcl-2 mRNA表达下降(P<0.01)以外,其它各指标变化趋势与28天相同(P<0.05或P<0.01)。与A组比较,姜黄素干预组各指标变化趋势与28天相同(P>0.05或P<0.05或P<0.01)。CC组与C组比较其细胞核P53蛋白、p53 mRNA、caspase-3 m RNA、Bax蛋白表达水平明显下降(P<0.01),bcl-2 m RNA表达显著增加(P<0.01)。说明抑制促凋亡基因、蛋白表达并促进抗凋亡基因的表达可能是姜黄素干预AFB1亚慢性暴露诱导的肉鸡肝细胞凋亡的重要分子机制,而且姜黄素的干预效果在停药7天内具有持续性。炎症和细胞增殖相关基因表达及TLR4/NF-κB通路活性检测结果:AFB1连续暴露28天,与C组比较,A组肝脏TNF-α、cyclin D1、IL-10、HO-1 m RNA表达及细胞质NF-κB p65蛋白表达显著减少(P<0.05或P<0.01),TLR4蛋白、细胞核NF-κB p65蛋白以及TGF-β、IL-1β、IL-6、IL-8、TLR4、NF-κB p65 m RNA表达增加(P<0.01)。姜黄素连续干预28天,相比于A组,姜黄素干预组TNF-α、cyclin D1、TGF-β、IL-10、HO-1 mRNA表达以及细胞质NF-κB p65蛋白表达增加(P>0.05或P<0.05或P<0.01),TLR4蛋白、细胞核NF-κB p65蛋白以及IL-1β、IL-6、IL-8、TLR4、NF-κB p65 m RNA表达量减少(P<0.05或P<0.01)。CC组较C组TNF-α、cyclin D1、TGF-β、IL-10、HO-1 mRNA表达水平显著升高(P<0.01),TLR4蛋白和NF-κB p65 mRNA表达水平显著降低(P<0.01)。停毒停药后第7天,与C组比较,A组除cyclin D1和TGF-βmRNA表达无变化以外,其它各项指标变化趋势均与28天相同(P<0.01)。与A组相比,姜黄素干预组各指标变化趋势与28天相似(P>0.05或P<0.05或P<0.01),仅TGF-βm RNA表达无明显变化。CC组与C组比较,TNF-α、cyclin D1、IL-10 m RNA表达增加(P<0.01),TLR4蛋白和基因以及细胞核NF-κB p65蛋白表达减少(P<0.01)。说明姜黄素可能通过促进抗炎基因和细胞增殖基因表达,并通过抑制TLR4/NF-κB通路抑制促炎基因表达,进而干预AFB1亚慢性暴露诱导的肝脏炎症和细胞增殖能力抑制,且其干预作用在停药7天内具有持续性。本研究结果表明,促进肝细胞自噬活动和细胞增殖相关基因的表达,抑制肝细胞凋亡、坏死及炎症,是姜黄素干预AFB1致肉鸡亚慢性肝损伤的重要机制,而且姜黄素的干预效果在停药7天内具有持续性。