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研究背景:i PSCs的发现使得再生医学研究取得革命性的进展。然而i PSCs的诱导过程存在效率低、耗时长的缺点,限制了其广泛的临床应用。作为cohesin复合物的重要组成部分,Smc1对维持基因组三维空间结构具有重要作用。Smc1介导的多能性基因增强子与启动子之间染色质内环的形成可激活内源性干性基因的表达,是重编程过程中的必要步骤。为进一步探索多能性相关的染色质空间结构的调节因素,本研究在i PSCs内进行Smc1 RIP-seq,结合实验室前期i PSCs及成纤维细胞(fibroblasts,Fibs)转录组测序的RNA-seq数据,筛选出与Smc1结合且在i PSCs中高表达的lnc RNA Silnr1进行研究。后续实验将探讨Silnr1对干细胞多能性调控及重编程进程的影响及其作用机制。研究目的:1.明确在不同多能性状态下Silnr1的表达特点及其与多能性的相关性。2.探讨Silnr1在调控干细胞多能性及重编程过程中的作用。3.探究Silnr1在基因组内具有相互作用的基因,明确其调控干细胞多能性及重编程的靶基因。4.探讨Silnr1调控干细胞多能性及重编程进程的表观遗传学机制。研究方法:1.结合RIP-seq和RNA-seq筛选出Smc1结合且在干细胞高表达的lnc RNA.收集不同多能性状态细胞及小鼠器官组织标本,应用实时荧光定量PCR(real time quantitative PCR,RT-q PCR)技术检测Silnr1表达情况。通过拟胚体分化实验监测Silnr1在拟胚体分化过程中动态表达情况,明确其与多能性的关系。RNA FISH明确其细胞内定位。2.构建Silnr1敲减及过表达质粒,进行Silnr1在干细胞内敲减及成纤维细胞内过表达的功能实验,RT-q PCR和免疫荧光染色检测多能性基因的表达水平,分析Silnr1在多能性调控中的作用。重编程实验观察Silnr1对重编程效率的影响。3.通过RAT-seq寻找与Silnr1具有相互作用的基因,明确Silnr1调控干细胞多能性及重编程的靶基因。RNA-DNA FISH进一步明确Silnr1的靶基因。4.通过染色质构象捕获(3C)、染色质免疫沉淀(Ch IP)实验探讨Silnr1的表观遗传学调控机制。研究结果:1.结合本研究进行的Smc1 RIP-seq及实验室前期RNA-seq结果共筛选出10条Smc1结合且在干细胞中高表达的lnc RNAs,将与Smc1结合最佳的lnc RNA命名为Silnr1并进行后续研究。2.定量实验显示,Silnr1在多能性干细胞中表达水平显著高于成纤维细胞及器官组织。在拟胚体分化过程中,Silnr1与干性相关基因具有相同的表达趋势。Silnr1位于细胞核内。3.功能实验显示,Silnr1敲减使得i PSCs发生分化,干性相关基因的表达水平下降,Silnr1敲减细胞的Oct4,Sox2免疫荧光染色荧光强度减弱。Silnr1过表达可激活干性基因,提高干性相关基因Oct4,Sox2的表达水平。重编程实验显示Silnr1能够提高重编程效率。4.RAT-seq结果显示Oct4是Silnr1发挥多能性调控作用的靶基因,其主要结合在Oct4基因的增强子和启动子区域。在i PSCs中,Silnr1 lnc RNA–Oct4 DNA FISH发现两者在空间上毗邻。5.Silnr1敲减使得Smc1与Oct4增强子和启动子区域结合水平下降,同时影响Oct4基因启动子与增强子之间染色质内环的形成。研究结论:1.结合RIP-seq和RNA-seq,本研究筛选出一条新的与Smc1结合的多能性相关lnc RNA-Silnr1。2.Silnr1可维持干细胞多能性。Silnr1敲减后多能性基因表达水平下降,多能性干细胞分化。3.Silnr1可激活干性基因,促进其表达,提高重编程效率。4.Silnr1结合在Oct4基因启动子和增强子区域,通过调控Smc1介导的基因启动子与增强子之间染色质内环的形成来调节干性基因的表达。