成人皮肤创伤后组织以再生方式愈合，但对于深及真皮的创面而言，机体修复的结果往往导致细胞外基质(Extracellular matrix，ECM)的堆积和瘢痕的形成。这不但影响美观，更由于瘢痕挛缩影响组织和器官功能[1-5]。相反，哺乳动物胚胎特定时期（早期和中期）的皮肤创伤往往以无瘢痕形式愈合。研究者普遍认为，皮肤无瘢痕是胚胎皮肤细胞本身的生物学特性决定[6-10]。随着近年来细胞生物学、生物化学和分子生物学领域对皮肤创面愈合的研究不断深入，人们对表皮角质形成细胞(Keratinocytes，KCs)在皮肤炎症、创面愈合、瘢痕形成和组织重塑方面起了关键的调节作用这一观点已形成共识，皮肤创伤发生后人表皮KCs与人真皮成纤维细胞(human dermal fibroblasts，hDFs)共同作用影响着创伤的修复[11-12]。研究表明，表皮KCs影响hDFs功能是通过一系列细胞因子来实现。一种方式是表皮来源的细胞因子或者生长因子直接或间接调节胶原合成，另一种是表皮细胞影响胶原溶解系统，表皮可以合成胶原酶或类似的金属蛋白酶，或者减少内源性蛋白酶抑制剂。无瘢痕愈合中胎儿表皮KCs对于hDFs功能的影响的相关研究较少。为此，我们研究中期和晚期妊娠胎儿表皮KCs生物学特性及共培养条件下中期和晚期妊娠胎儿表皮KCs对hDFs功能和多种基因表达的影响。　　研究者通过基因表达谱芯片技术已经发现了中期妊娠和晚期妊娠胎儿皮肤组织中存在大量基因的差异表达，检测结果提示皮肤组织基因表达谱和皮肤表型的复杂调控模式[14-16]。微小RNA是存在于动植物中的一类高度保守的非编码小分子RNA。它们可以特异性的与靶基因mRNA的3非翻译区发生互补结合，影响蛋白的翻译过程或使靶基因mRNA降解，以此对靶基因产生抑制作用。近年来，在皮肤创伤愈合过程中发现许多微小RNA可能对创伤愈合产生作用，它们的差异表达与皮肤创伤愈合的发展、预后等过程有着显著的相关性[17]。　　由于胎儿从无瘢痕愈合到有瘢痕形成过程中表皮生物学功能的改变与基因表达谱变化相关，而微小RNA通过与靶基因相互作用影响基因表达。然而，有关中期和晚期妊娠胎儿表皮KCs微小RNA表达谱尚不明晰。为了揭示微小RNA在中期和晚期妊娠胎儿表皮KCs生物学行为中的作用机制，我们通过高通量微小RNA表达谱测序技术进行全景式分析，以其深入探讨无瘢痕愈合分子机制，并为临床瘢痕治疗提供可能的分子靶标。　　方法:　　一、中期和晚期妊娠胎儿表皮KCs生物学特性的研究　　1、观察不同胎龄胎儿表皮组织形态学特征。　　2、原代人中期和晚期妊娠胎儿表皮KCs培养与鉴定。　　3、利用WST-1细胞增殖实验检测中期和晚期妊娠胎儿表皮KCs增殖能力。　　4、利用体外划痕实验检测中期和晚期妊娠胎儿表皮KCs迁移活性。　　5、利用流式细胞技术检测中期和晚期妊娠胎儿表皮KCs表面标志物。　　二、建立共培养体系研究中期和晚期妊娠胎儿表皮KCs对hDFs功能和基因表达的影响　　1、成年hDFs原代培养与鉴定。　　2、利用Transwell建立人中期和晚期妊娠胎儿表皮KCs与hDFs共培养体系。　　3、利用WST-1细胞增殖实验检测中期和晚期妊娠胎儿表皮KCs细胞对真皮成纤维细胞增殖活性的影响。　　4、利用体外划痕实验检测中期和晚期妊娠胎儿表皮KCs对hDFs迁移的影响。　　5、利用实时定量PCR技术检测中期妊娠和晚期妊娠胎儿表皮KCs对hDFs基因表达的影响。　　6、利用Western Blot检测中期妊娠和晚期妊娠胎儿表皮KCs对hDFs的基因表达的影响。　　三、中期和晚期妊娠胎儿表皮KCs微小RNA表达谱的研究　　1、提取中期妊娠组和晚期妊娠组胎儿表皮KCs的RNA，应用微小RNA表达谱（illumina miRNA测序）技术测序。　　2、利用实时定量PCR技术验证中期和晚期妊娠胎儿表皮KCs的差异表达miRNA。　　3、生物信息学分析差异基因表达模式聚类分析，Gene Ontology功能显著性富集分析，Pathway显著性富集分析。　　四、miR-203和miR-495与表皮细胞功能的相关性研究　　1、利用脂质体转染法将hsa-miR-203和hsa-miR-495模拟物转入人表皮HaCaT细胞系。　　3、利用WST-1实验检测差异表达的hsa-miR-203和hsa-miR-495对HaCaT细胞系增殖能力的影响。　　3、利用体外划痕实验检测差异表达的hsa-miR-203和hsa-miR-495对HaCaT细胞系迁移能力的影响。　　结果:　　一、中期和晚期妊娠胎儿表皮KCs的生物学特性　　1、中期和晚期妊娠胎儿表皮KCs培养与鉴定。　　2、中期妊娠组胎儿表皮KCs增殖能力显著升高。　　3、中期妊娠组胎儿表皮KCs迁移能力显著升高。　　4、中期妊娠组胎儿表皮KCs高表达CK14和CK19，不表达CK10，而晚期妊娠组KCs高表达CK14，不表达CK10和CK19。　　二、中期和晚期妊娠胎儿表皮KCs对hDFs功能和基因表达的影响　　1、成年hDFs原代培养与鉴定。　　2、建立人中期和晚期妊娠胎儿表皮KCs与hDFs共培养体系。　　3、中期妊娠组胎儿表皮KCs共培养明显促进hDFs增殖。　　4、中期妊娠组胎儿表皮KCs共培养明显促进hDFs迁移。　　5、中期妊娠组和晚期妊娠组胎儿表皮KCs共培养能差异调节hDFs多种基因的表达。　　三、中期和晚期妊娠胎儿表皮KCs微小RNA表达差异及其对应的靶基因筛选　　1、人中期妊娠组胎儿KCs明显上调的微小RNA。　　2、人中期妊娠组胎儿KCs明显下调的微小RNA。　　3、微小RNA-495和微小RNA-203在人中期妊娠组胎儿KCs中表达明显下调。　　四、miR-203和miR-495影响表皮细胞系HaCaT的增殖和迁移　　1、构建差异表达hsa-miR-203和hsa-miR-495的HaCaT细胞系。　　2、体外实验证明hsa-miR-203和hsa-miR-495抑制表皮细胞增殖和迁移。　　五、miR-203和miR-495影响表皮系HaCaT增殖和迁移的机制　　1、生物信息学预测SMAD7、CUL和SMUFR2可能是miR-203影响表皮KCs功能的靶基因。生物信息学预测SMAD7、CUL和RBX1可能是miR-495影响表皮KCs功能的靶基因。　　结论:　　1、中期妊娠组与晚期妊娠组胎儿表皮KCs具有不同的生物学特征。　　2、中期妊娠组与晚期妊娠组胎儿表皮KCs对真皮成纤维细胞功能和基因表达的影响不同。不同EGA胎儿表皮细胞共培养能差异的调节成年hDFs MMPs和TIMPs基因表达。妊娠中期组表皮细胞共培养能明显促进MMP-1，MMP-2，MMP-3，MMP-9， MMP-14基因表达，明显降低TIMP-2和TIMP-3基因表达。晚期妊娠组KCs共培养能明显促进MMP-2，MMP-3，MMP-9，MMP-14基因表达，明显降低TIMP-1，TIMP-2和TIMP-3基因表达。MMP-3，MMP-9，MMP-14，TIMP-1，TIMP-2，TIMP-3基因表达在中期妊娠中期和晚期组间差异明显与晚期妊娠组表皮KCs相比，中期妊娠组表皮KCs对hDFs功能和基因表达的影响更有利于无瘢痕愈合。　　3、中期妊娠组与晚期妊娠组胎儿表皮KCs多种微小RNA差异表达可能是造成胎儿无瘢痕愈合的重要因素之一。　　4、中期妊娠组多种微小RNA可能通过参与调控多种mRNA表达来影响KCs功能。　　5、中期妊娠组KCs低表达miR-203和miR-495。　　6、过表达miR-203和miR-495抑制表皮细胞增殖和迁移能力。　　7、miR-203和miR-495可通过调节SMAD7、CUL、SMUFR2和RBX1基因表达发挥调节表皮细胞功能作用。