胚胎干细胞(embryonic stem cells，ESCs)衍生自植入前囊胚内细胞团(inner mass cells，ICM)或原始生殖细胞(primordial germ cells，PGCs)，在体外进行培养传代能够保持未分化状态，且能维持正常的二倍体染色体结构，具有分化发育成三个胚层组织细胞潜能的全能性细胞。将人胚胎干细胞进行定向诱导分化成人体体细胞可用于细胞或组织器官的移植，同时胚胎干细胞的发现还为研究细胞分化，物种发育机制，阐明基因功能，筛选药物等开辟了广阔的空间。因此人胚胎干细胞相关研究成为世界各个研究领域的热点而备受瞩目。但至今人胚胎干细胞仍缺乏高效、稳定的建系方法，体外培养条件苛刻，容易自发分化，这些都阻碍了人胚胎干细胞研究与应用的脚步。人胚胎干细胞建系的关键在于：①状态稳定良好的饲养层细胞；②质量良好的囊胚；③可靠、稳定的培养方法；④有效的内细胞团分离；⑤可靠、有效的传代。根据抑制细胞分化因子的来源不同分为饲养层培养体系和无饲养层培养体系，目前已有研究证实人胚胎干细胞的培养有赖于饲养层体系；建系过程中常用的培养方法有全胚培养法和免疫外科法，两种方法均有建系成功的报道，而何种更优仍无定论；在使用免疫囊胚刀分离内细胞团的过程中，何种浓度的抗体与补体能够高效分离内细胞团；在原代克隆接种后，适时的进行传代可保证其最大增殖同时不发生自发分化，拟通过检测体外培养不同天数ICM ES样标记表达情况摸索适时的离散时机。本研究在前期鼠胚胎干细胞建系的基础上，利用本中心新鲜废弃胚胎，从囊胚质量与结局的关系，两种不同培养方法，有效分离内细胞团的方法和最佳传代时机等四个方面，对影响成功建系的因素进行分析，探寻可靠、高效建立人胚胎干细胞的方法，为最终成功建立人胚胎干细胞系提供方法指导和理论依据。方法1、取孕12.5—14.5天昆明小鼠的胎鼠，制作鼠成纤维细胞饲养层。2、收集本中心2005年5月至2007年1月间进行的IVF-ET周期新鲜废弃胚胎，培养至囊胚并评分。所有用于研究的胚胎均经患者知情同意。3、囊胚随机分为两组，一组去透明带后直接置于饲养层进行全胚培养；另一组使用免疫外科法分离ICM后再接种于饲养层培养。记录每个囊胚贴壁、原代克隆形成及传代情况。4、免疫外科法分离ICM时囊胚置于四组不同浓度的兔抗人血清和新鲜豚鼠血清中，观察滋养外胚层去除和ICM完整情况。5、免疫法分离出ICM置于ES培养微滴中培养，隔日换液，分别于培养D5、D6、D7、D8、D9、D10、D11、D12分别用染料着色方法检测ICM ES样标记碱性磷酸酶(alkaline phosphatase，AKP)活性和细胞免疫荧光法检测胚胎表面阶段特异性标记4(stage specific embryonic antigen 4，SSEA-4)的表达情况。结果1、胚胎收集及培养情况本实验共收集D3新鲜废弃胚胎共257枚，体外培养后102枚发育至囊胚，囊胚形成率为39.7％，其中用于建系的3-4AA级／3-4BA级囊胚13枚，3-4AB级／3-4BB级23枚，3CC级15枚。余51枚用于检测培养不同天数ICM ES样标记表达情况。2、囊胚质量与结局3-4AA级／3-4BA级囊胚：13枚，接种12枚，贴壁11枚，贴壁率为91.7％，形成典型克隆4个，克隆形成率为33.3％，可传代2个，传代率16.7％。3-4AB级／3-4BB级囊胚：23枚，接种20枚，贴壁14枚，贴壁率为70％，形成典型克隆5个，克隆形成率为25％，可传代1个，传代率5％。3CC级囊胚：15枚，接种5枚，贴壁0枚，形成克隆0个，传代0个。3-4AA级／3-4BA级和3-4AB级／3-4BB级囊胚各项指标均高于3CC级，3-4AA级／3-4BA级囊胚传代率高于3-4AB级／3-4BB级囊胚，P＜0.05，而贴壁率和原代克隆形成率无统计学差异，P＞0.05。3、不同培养方法对原代克隆生长的影响全胚培养法：囊胚19枚，贴壁10个，贴壁率为52.6％，形成典型的原代克隆3个，克隆形成率为15.8％，均为能传代。免疫外科法：囊胚32个，分离出完整的进行接种ICM18个，贴壁15个，贴壁率为83.3％，形成典型的原代克隆6个，克隆形成率为33.3％，其中三个传至3代，停止增殖，未能建系。两种培养方法比较，免疫外科法组的贴壁率、克隆形成率及传代数均高于全胚培养法组，P＜0.05。4、不同浓度血清免疫法分离ICM比较1：8兔抗人血清+1：8新鲜豚鼠血清：滋养外胚层细胞无明显改变，完全不能去除。1：4兔抗人血清+1：4新鲜豚鼠血清：滋养外胚层细胞少量细胞肿胀，去除不完全。1：2兔抗人血清+1：2新鲜豚鼠血清：外滋养细胞与内细胞团全部溶解。1：2兔抗人血清+1：4新鲜豚鼠血清：外滋养细胞肿胀，去除完全，内细胞团完整。5、体外培养不同天数ICM AKP活性和SSEA-4表达情况AKP活性：体外培养至D5、D6、D7 ICM着色后为蓝紫色，呈阳性(+)表达；D8、D9、D10着色渐淡，部分区域不着色，呈弱阳性(±)；D11、D12 ICM完全不着色，呈阴性(-)。SSEA-4：体外培养至D5、D6、D7、D8 ICM荧光显微镜下观察可见细胞团发出绿色荧光，呈阳性(+)表达；D9、D10绿色荧光渐暗，呈弱阳性(±)；D11、D12 ICM不再有荧光，镜下仅见细胞间界限明显的细胞团，SSEA-4表达呈阴性(-)。结论1、原代建系建议使用3BB级以上的囊胚。质量差的囊胚，细胞数目少、增殖能力差，不能进行有效的扩增传代。2、免疫外科法在分离ICM的同时也是对质量差的胚胎的淘汰，去除滋养外胚层减少了外滋养细胞与内细胞团共培养对其产生的诱导分化作用，从而提高贴壁率和原代克隆形成率，是一种更为高效的原代培养方法。3、免疫囊胚刀采用1：2倍比稀释的兔抗人血清和1：4倍比稀释的新鲜豚鼠血清可在有效去除滋养外胚层细胞的同时保证内细胞团的完整性。4、在保证细胞最大的增殖的条件下，ES样克隆离散的时机应选择在接种培养后7-10天，最长不可超过10天，以避免细胞发生自发分化。