百合‘索邦’组蛋白去乙酰化酶HDA1-like基因家族功能研究

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表观遗传修饰是在不改变基因序列的情况下,由于外界环境等因素导致的可遗传变异。组蛋白的乙酰化和去乙酰化是表观遗传修饰中最为重要的组蛋白修饰之一。HDA1/RPD3基因家族是组蛋白去乙酰化酶超家族HDACs中含有一个高度保守的去乙酰化酶结构域的亚家族,其功能在模式植物中已有较多研究,但以去乙酰化修饰为主的表观遗传修饰在观赏植物生长发育、逆境抗性、品质性状形成中的潜在功能仍少有报道。东方百合‘索邦’(Lilium oriental hybrid‘Sorbonne’)是世界重要的切花品种。鳞茎是百合世代演替的核心器官,其繁殖是百合切花生产的首要环节,低温诱导鳞茎休眠解除机制尚不清楚。表观遗传修饰在调控百合鳞茎发育、更新及逆境抗性中的分子功能值得深入研究。本研究以‘索邦’为材料,克隆了HDA1-like家族成员的全长编码序列;分析了该家族的保守结构和系统进化等特征;依据它们在组织器官、鳞茎发育过程和非生物胁迫中的表达模式,筛选出关键基因;转化拟南芥,解析这些成员的功能。本研究得到的主要结果有:1.LoSorHDA1-like基因家族成员克隆与生物信息学分析。从东方百合‘索邦’中克隆到LoSorHDA1/2/5/6/8/9/14/15基因家族成员8个,核苷酸序列大小在1059-2082bp,编码的氨基酸序列在352-693 aa。按照蛋白保守结构和系统进化特征,划分为Class I(LoSorHDA1/6/9)、II(LoSorHDA5/8/14/15)和IV(LoSorHDA2)三个亚组。系统进化表明LoSorHDA1-like家族成员与单子叶植物油棕和小果野蕉的亲缘关系最近。各成员均含有一个高度保守的组蛋白去乙酰化酶结构域,是该基因家族的特征结构域。2.LoSorHDA1-like基因家族表达模式。该家族基因在百合‘索邦’的营养和生殖器官中均广泛表达,且存在表达差异。鳞茎更新发育阶段,大部分成员在现蕾至采收前表达趋势类似,均在开第一朵花和花谢17周后出现表达高峰。LoSorHDA9的表达量在花谢后迅速上升,并在花谢17周后达到峰值,表明LoSorHDA9很可能参与鳞茎后期的快速膨大发育及休眠诱导。冷藏期间和定植后阶段,所有成员均出现不同水平的表达,LoSorHDA1/5/8/9/14/15在低温冷藏阶段均上调表达,LoSorHDA2/6在常温贮藏下表达明显上调,定植2周后所有成员的表达量轻微下调后仍保持较高水平。LoSorHDA1-like基因成员均受到盐、高温胁迫和ABA的诱导上调或下调表达,在茎生根(茎尖)和叶片中的表达趋势相反。大部分基因在叶片中的表达量显著受到盐和高温诱导,分别在12-24 h和3 h出现表达高峰,尤其LoSorHDA1等基因的表达显著受到高温诱导上调,说明它们可能参与调节百合高温胁迫。大部分成员在茎尖中对ABA处理更加敏感,在处理后12 h表达量最大或最小。3.LoSorHDA1-like基因家族功能研究。烟草表皮细胞的亚细胞定位可知,LoSorHDA2和LoSorHDA5定位于细胞质,LoSorHDA15定位于细胞核,LoSorHDA1/6/8/9/14均同时定位于细胞核和细胞质。T2代转基因株系表型特征分析表明,LoSorHDA9过表达株系的幼苗在盐和高温胁迫下平均成活率分别为23.0%和16.0%,均极显著低于野生型WT和突变体hda9-1,各株系在盐胁迫下的平均萌发率为56.5%,均低于野生型WT(83.0%)和突变体hda9-1(90.0%),说明LoSorHDA9过表达对盐和高温胁迫的抗性减弱。LoSorHDA9恢复表达LoSorHDA9/hda9-1-T2代各株系开花后平均莲座叶数量为16.2片,明显多于野生型WT(10)和突变体hda9-1(10.7),各株系平均抽薹开花时间为25.1 d,明显晚于野生型WT(22 d)和突变体hda9-1(20 d),出现营养生长阶段延长现象。花序分生点和初级莲座叶分枝数增多至2-3个,各分枝同时抽薹开花,无明显主茎。本研究表明LoSorHDA9基因作为百合LoSorHDA1-like基因家族中的关键候选基因之一,负调控盐和高温胁迫响应过程,这与拟南芥的研究一致,它还可能参与鳞茎后期快速膨大发育,而百合的HDA9基因转入拟南芥突变体会显著推迟其开花时间,影响侧枝发育。关于基因在这些过程中的具体作用机制,需后续通过蛋白互作,特定阶段中的组蛋白乙酰化水平检测和转基因等研究,来进一步确定LoSorHDA9等基因在百合开花等生长发育中发挥的特定功能。
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