金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus,简称金葡菌)广泛存在于自然环境中,可通过多种渠道污染食品,是引起细菌性食物中毒的重要病原菌之一。目前在全球范围内由金黄色葡萄球菌引起的食物中毒在细菌性食物中毒中均占有较大比例。金葡菌能够分泌多种致病性物质,其中肠毒素是金葡菌导致食物中毒和过敏性休克的关键毒力因子。目前研究确定的SE共有11种,分别是SEA、SEB、SEC、SED、SEE、SEG、 SEH、SEI、SER、SES和SET。但是国内外有关SE分布及表达的研究所用菌株大多来源于临床病例,对食品安全方面的意义不大,此外,国内外有关肠毒素在食品中表达规律研究甚少。因此,本试验研究肠毒素基因在食品中的分布及其在液体培养基和五香牛肉中的相对表达水平,揭示其时序性表达规律,同时为预防和控制金葡菌中肠毒素的表达提供一定的基础和支撑。1.金黄色葡萄球菌的分离鉴定及在食品中的分布研究本试验旨在研究食源性金黄色葡萄球菌各血清型肠毒素基因的分布。采用微生物传统检测方法和PCR扩增方法,对收集的2514份样品(肉制品486份,豆制品350份,乳制品384份,水产品446份,牛乳480份,生鲜肉368份)进行检测,共分离金黄色葡萄球菌51株,金黄色葡萄球菌在肉制品中的检出率最高3.91%。本研究以16sRNA基因为内参基因,采用双重PCR方法鉴定各肠毒素的基因型。结果发现除ses、set和see外,在51株食源性金黄色葡萄球菌菌株中其余8种肠毒素基因均有检出,阳性率达43.14%,其中,sei和seg的阳性率(27.45%)显著高于其它血清型；传统的5种肠毒素血清型中以sed(13.73%)检出率最高。2.金黄色葡萄球菌肠毒素基因在液体培养基中的时序性表达分析本试验旨在研究各肠毒素在液体培养基中的时序性表达规律。通过检测不同生长时期菌体OD600吸光度值,绘制金葡菌的生长曲线,分别在达到各个生长时期所对应的吸光值时立即收集菌体提取细菌总RNA,以ftsZ和ropB作为内标基因,采用改良的ΔΔCt法进行定量分析,利用反转录荧光定量PCR技术,研究各肠毒素基因在液体培养基中不同生长时期的表达水平变化。结果发现,各肠毒素基因在mRNA水平的时序性表达规律基本一致：均在对数后期达到峰值,随后快速下降。以内标基因为参照,同一菌株中不同肠毒素基因的相对表达量以及不同菌株中同一肠毒素基因的相对表达量均差异较大。3.金黄色葡萄球菌典型肠毒素在牛肉制品中的表达水平研究由于目前国际上缺乏肠毒素在食品中表达情况研究,本试验旨在研究肠毒素sea-sed在中国传统五香牛肉中的表达规律。本试验对采取中国传统五香牛肉加工工艺生产的牛肉,人工污染分别携带有肠毒素sea、seb、sec、sed的金葡菌约104CFU/g,在23℃恒温培养。分别在培养第1、2、3、5、7d取样,将个样品分别进行细菌计数、毒素基因反转录表达分析和毒素检测。结果发现培养1-2d细菌数即可达到最大值；在传统牛肉培养过程中,sea-sed的mRNA均有检出,且峰值出现在培养的第1或2d；此外,肠毒素sea-sed在传统牛肉中的反转录相对表达水平均在培养的过程中出现二次提高现象；在培养过程中各目标肠毒素检测均显示阳性。