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目的应用高浓度反复间歇法建立人肺腺癌A549培美曲塞耐药细胞株A549/PEM,探讨PTEN、m TOR、AICARFT在人肺腺癌亲本株A549及培美曲塞诱导人肺腺癌耐药株A549/PEM中的表达变化及意义。方法1应用高浓度反复间歇法建立人肺腺癌A549培美曲塞耐药细胞株A549/PEM。首先应用MTT法对培美曲塞药物诱导浓度进行反复筛选,根据抑制率以及细胞在药物作用下的形态学改变选取高浓度的培美曲塞,诱导A549细胞获得耐药细胞,命名耐药细胞为A549/PEM。在无药培养基中脱药培养,经过传代、冻存、复苏等过程,观察A549/PEM细胞株的稳定性,MTT法检测其耐药性,重复上述细胞诱导过程并计算耐药指数。2显微镜下观察比较A549及A549/PEM的形态学变化,通过MTT法分别绘制A549及A549/PEM的细胞生长曲线、计算倍增时间;应用流式细胞术检测A549及A549/PEM细胞周期。3应用MTT法检测A549/PEM对顺铂、紫杉醇、依托泊苷、长春新碱的耐药性。4分别提取A549及A549/PEM的蛋白质及RNA,应用Western-blot及Real-time PCR技术检测PTEN、m TOR、AICARFT蛋白及基因水平的表达变化。结果1根据肿瘤细胞抑制率以及A549细胞受到药物作用后形态学改变选取终浓度为500ng/ml的培美曲塞,反复间歇冲击培养A549细胞约4个月,建立人肺腺癌A549培美曲塞耐药细胞株A549/PEM,A549/PEM耐药指数为(26.87±1.81),较亲本株A549耐药指数升高约27倍。2显微镜下显示A549/PEM细胞较A549细胞形态不规则;A549和A549/PEM增殖速度接近,倍增时间分别为(63.26±0.65)h和(62.45±0.50)h(P=0.162)。3 A549细胞处于细胞周期G1期的比例为(57.71±0.77)%,A549/PEM细胞处于G1期为(56.74±0.47)%(P=0.137),A549细胞处于细胞周期G2/M期的比例为(12.22±2.08)%,A549/PEM细胞处于G2/M期为(7.93±1.80)%(P=0.55),A549和A549/PEM处于G1期及G2/M期细胞比例无明显变化,差异无统计学意义,处于S期的A549/PEM较A549明显增多,分别为(35.32±2.21)%和(30.06±1.61)%(P=0.029),差异具有统计学意义。4 A549/PEM同时对顺铂、依托泊苷耐药,耐药指数分别为(1.93±0.02)和(8.26±1.55);A549/PEM对紫杉醇、长春新碱敏感,耐药指数分别为(0.89±0.10)和(0.95±0.11)。5 A549/PEM细胞的PTEN、m TOR、AICARFT的m RNA表达水平均较A549表达上调(P<0.01)。A549细胞PTEN、mTOR、AICARFT的mTOR相对表达量分别0.99±0.01、0.99±0.02、0.99±0.02,A549/PEM的m RNA细胞表达量相对于A549分别为2.24±0.16、2.18±0.04、2.14±0.04。6 A549/PEM表达的PTEN、m TOR、AICARFT蛋白均较A549细胞表达上调(P<0.01)。A549细胞表达的PTEN、m TOR、AICARFT灰度值分别为396.76±28.66、404.94±53.47、412.21±96.48,相对表达量(GAPDH)分别为0.29±0.02、0.30±0.04、0.31±0.07。A549/PEM表达的PTEN、m TOR、AICARFT灰度值分别为815.43±73.92、861.40±169.52、894.18±128.73,相对表达量(GAPDH)分别为0.65±0.32、0.71±0.24、0.72±0.20。结论1本研究通过高浓度反复间歇法成功建立了人肺腺癌A549/PEM培美曲塞耐药细胞株模型。2 A549/PEM对顺铂、依托泊苷交叉耐药,对紫杉醇、长春新碱敏感,可以为培美曲塞耐药后的选择提供参考。3人肺腺癌A549细胞出现培美曲塞获得性耐药后AICARFT、m TOR、PTEN的表达上调。