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戊型肝炎（Hepatitis E）是由戊型肝炎病毒（Hepatitis E virus,HEV）感染引起的一种急性自限性肝炎。孕妇感染HEV后死亡率可达到20%。近年来,戊型肝炎已成为危害人类健康的重要疫病之一,此外,其作为一种人畜共患病具有重要的公共卫生学意义。HEV属于肝炎病毒科,为无囊膜单股正链RNA病毒,哺乳动物HEV分离株可分为8个基因型,其中基因1和2型仅感染人,基因3型、4型和8型具有人畜感染性。在我国,人群中主要流行基因1型和4型,猪群中流行基因4型,兔群中流行基因3型。HEV ORF3蛋白是一种小的具有很强抗原性的磷酸化蛋白（p ORF3）,长约113个氨基酸。近年来,随着对HEV ORF3蛋白深入研究,发现该蛋白与病毒的释放以及对宿主的致病损伤密切相关,但参与该过程的宿主蛋白却没有相关系统的研究报道,阻碍了HEV致病机理的深入研究。本课题选取人HEV基因1型SAR-55株、基因3型Kernow-C1株、基因4型猪HEV CHN-SD-s HEV株以及基因3型兔HEV CHN-SX-r HEV株的ORF3蛋白为研究对象,利用互作蛋白质组学系统分析了与上述不同基因型HEV ORF3蛋白互作的宿主蛋白的种类,并进一步利用生物信息软件分析了参与互作的宿主蛋白的生理功能以及在组织中的分布情况。其研究内容和结果简述如下:1.真核表达携带Fc标签的HEV ORF3蛋白首先,利用PCR成功扩增获得了预期350 bp大小的不同基因型HEV ORF3的基因片段,以及预期670 bp大小的Ig G Fc片段。通过Overlap PCR扩增获得了预期1030bp大小的ORF3与Fc融合基因。然后利用双酶切、连接成功构建了不同基因型HEV ORF3与Fc融合蛋白的重组真核表达载体:p CAGEN-SAR-55 ORF3-Fc,p CAGEN-Kernow-C1 ORF3-Fc,p CAGEN-s HEV ORF3-Fc,p CAGEN-r HEV ORF3-Fc以及p CAGEN-Fc。将重组表达载体转染HEK293T后,免疫荧光和Western blot实验证实不同基因型HEV ORF3与Fc融合蛋白成功在HEK293T细胞中获得表达。2.筛选并验证与不同基因型HEV ORF3蛋白互作的宿主蛋白利用Fc蛋白与Protein G结合的特性,通过Co-IP,获得不同基因型HEV ORF3蛋白与HEK293T细胞互作的宿主蛋白混合物,SDS-PAGE后银染分析发现,存在多个与HEV ORF3蛋白互作的特异性宿主蛋白。然后,将互作混合物经液相色谱-质谱串联技术进行鉴定,结果发现,与Kernow-C1 ORF3互作的蛋白有140个,与SAR-55 ORF3互作的蛋白有117个,与CHN-SD-s HEV ORF3互作的蛋白有134个,与CHN-SX-r HEV ORF3互作的蛋白有91个。韦恩图分析与四种不同基因型HEV ORF3蛋白共同互作的宿主蛋白有22个。使用Gene Ontology（GO）分析蛋白的功能和信号通路显示这些蛋白所处的细胞组分主要为细胞外分泌体,髓鞘,线粒体,主要参与基因表达的正调节和细胞粘附等生物学过程。根据质谱结果和蛋白的功能,从互作的22个宿主蛋白中选取MYPT1、MYO1D、DBN1和TXNDC5宿主蛋白,利用上述蛋白的特异性抗体,Western blot进一步验证其与HEV ORF3蛋白的相互作用。综合质谱结果和实验目的,为了研究ORF3的组装是否影响病毒的释放,确定内质网蛋白TXNDC5作为研究对象。3.宿主蛋白TXNDC5与ORF3蛋白互作区域的验证首先,RT-PCR扩增获得编码宿主因子TXNDC5的c DNA;然后,通过酶切、连接成功构建TXNDC5的真核表达载体p CAGEN-TXNDC5-Myc。与ORF3的真核表达载体p CAGEN-ORF3-Fc-His共转染HEK293T细胞,免疫共沉淀和Western blot进一步验证TXNDC5与不同基因型的ORF3的相互作用。利用生物信息软件,分析不同基因型HEV ORF3蛋白的功能区;通过PCR扩增不同功能区的ORF3蛋白片段,并构建真核表达载体,与p CAGEN-TXNDC5-Myc共转染HEK293T后,免疫共沉淀和Western blot验证ORF3蛋白和TXNDC5蛋白的互作区域在ORF3的N端（氨基酸5-23）区域,该区域在不同基因型的ORF3中高度保守,并且富含半胱氨酸。