1.背景肺癌患者的死亡率处于各种恶性肿瘤的首位,侵袭和转移是肺癌治疗失败的重要原因之一。肿瘤的侵袭和转移是一个多环节、多步骤的复杂过程,涉及的细胞因子及分子机制为肿瘤的防治提供了靶点。环氧化酶(cyclooxygenase, COX)就是其中非常重要一条途径。COX是分解花生四烯酸((arachidonic acid, AA)生成各种内源性前列腺素(Prostaglandins, PGs)过程中关键的限速酶。1991年研究证实有两种COX存在,即结构型COX-1和诱生型COX-2。COX-1被认为是“看家”基因,几乎在所有正常组织中结构性表达,介导维持生理性自身稳定的前列腺素合成,因而具有保护胃表面上皮细胞,扩张肾血管等功能。COX-2为可诱生型COX,正常生理状态下多数组织内检测不到。当细胞受到炎症信号、某些细胞因子等刺激后表达增加。研究证实,COX-2的表达在包括肺癌在内的多种肿瘤中明显增高,COX-2表达阳性组肿瘤有更强的侵袭性,患者生存期缩短,提示COX-2与肿瘤的生长、侵袭转移及患者不良预后密切相关。COX-2表达强度以非小细胞肺癌(Non-Small Cell Lung Cancer, NSCLC)中的腺癌最高,呈中强而广泛的表达,其次为鳞癌,小细胞肺癌中只有很少个别病例能检测到中等水平的表达。COX-2在正常支气管上皮细胞和肺泡上皮细胞未见表达或弱表达。COX-2可通过多种致癌机制参与NSCLC的发生发展,有研究提出,虽然肿瘤的侵袭和转移是一个多步骤的复杂过程,但COX-2,很可能是这一过程的一个中心调控因素。目前对COX-2有抑制作用的药物主要是非甾体类抗炎药((non-steroidal anti-inflammatory drugs, NSAIDs),包括COX非选择性抑制剂和COX-2选择性抑制剂。COX非选择性抑制剂因同时抑制了COX-1而存在不容忽视的消化道副作用如消化道溃疡甚至出血；COX-2选择性抑制剂的胃肠道副作用减轻,但COX-2选择性抑制剂的肾毒性和引起心血管不良事件发生率增高的副作用同样不容忽视,使COX-2选择性抑制剂在肿瘤防治中长期应用的安全性受到质疑。更为安全有效的COX-2抑制剂有待进一步研究和发现。川芎嗪(tetramethylpyrazine, TMP),是从中药川芎中分离提纯出来的一种生物碱,其化学结构明确,为四甲基吡嗪,我们熟知的药理作用包括阻滞平滑肌的钙通道、抑制血小板聚集及激活等,目前临床主要应用于缺血性心、脑血管疾病的治疗。在中国,中医活血化淤法及其方药治疗肿瘤有悠久的历史和确切的疗效,而川芎嗪作为活血化淤类中药川芎的提取物,关于其在肿瘤防治中的研究报导,自上个世纪八十年代以来陆续出现并日益受到人们的关注。我们课题组前期研究发现川芎嗪可调节肺癌患者的Th1/Th2平衡而发挥抗肿瘤的免疫治疗作用。研究显示川芎嗪还可通过诱导肿瘤细胞的凋亡,改善荷瘤机体的高凝状态等方面,抑制肺癌的生长和侵袭转移,在肿瘤的预防和治疗中,显示出重要的应用价值和良好的应用前景。但也有研究报导,川芎嗪可在不同程度上增加肺癌细胞的粘附。而且,目前关于川芎嗪在肺癌防治中的作用,主要局限于动物实验或细胞行为的观察,对于其作用的细胞分子机制知之甚少,对于细胞因子、基因调控和信号转导通路等方面的研究,还有待进一步深入。2004年,万敬员等研究发现川芎嗪可显著减少脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)刺激的小鼠心肌巨噬细胞COX-2mRNA和蛋白表达,从而拮抗LPS诱导的乳鼠心肌细胞凋亡,但对COX-2活性无明显作用。2008年,张凌等研究发现川芎嗪可明显减少急性肺血栓栓塞症大鼠COX-2的表达,从而减轻炎症反应。但是自发现COX-2以来,关于川芎嗪对肺癌中COX-2的作用及其意义尚未有报导。鉴于此,我们设想以COX-2为切入点,对川芎嗪在肺癌特别是肺癌侵袭转移中的作用及其细胞分子机制进行探讨。根据COX-2在肺癌中的表达特性,我们选用了COX-2表达较高的人肺腺癌A549细胞进行研究。选取COX非特异性抑制剂吲哚美辛(indomethacin, IN)为阳性对照药物。因为目前关于川芎嗪对A549细胞作用的相关研究甚少,因此我们首先观察了不同浓度川芎嗪对A549细胞增殖活性的影响,并对其机制进行了初步探讨,主要目的在于筛选下一步实验所选用的川芎嗪实验浓度和观察时间点。第二部分,我们利用Transwell细胞侵袭实验以及建立肿瘤肺转移的动物模型,通过体外和体内实验观察川芎嗪对A549细胞侵袭和转移能力的影响。第三部分,我们分别从酶活性、蛋白表达、催化产物和组织水平检测了上述过程中川芎嗪对A549细胞COX-2的影响,对COX-2在川芎嗪抑制肺癌A549细胞侵袭转移中的作用进行探讨。2.研究内容第一部分川芎嗪对人肺癌A549细胞增殖的作用及机制研究目的(1)观察川芎嗪对A549细胞增殖活性的影响,并对其机制进行初步探讨；(2)筛选下一步实验选用的川芎嗪浓度和作用时间点。方法研究选用药物为盐酸川芎嗪注射液,(北京市永康药业有限公司,40mg/2m1)。盐酸川芎嗪注射液是目前临床和实验室研究川芎嗪常用的药物剂型,也便于保证细胞实验和动物实验所用研究药物的一致性。(1)MTT方法检测川芎嗪对A549细胞增殖活性的作用：100～1000μg/ml共十个川芎嗪浓度组,分别与A549细胞培养24,48和72小时,MTT方法检测各组细胞相对存活率(2)流式细胞术检测川芎嗪对A549细胞的细胞周期影响：A549细胞与200μg/ml川芎嗪(TMP200组),400μg/ml川芎嗪(TMP400组),800μg/ml川芎嗪(TMP800组),以及阳性对照200μM吲哚美辛(rN组)分别培养24、48和72小时,收集细胞,流式细胞术检测各组细胞周期的百分比。(3) Werstem blot方法检测川芎嗪对A549细胞中ERK1/2蛋白表达的影响：A549细胞与200μg/ml川芎嗪(TMP200组),400μg/ml川芎嗪(TMP400组),200μg/ml川芎嗪(TMP800组),以及阳性对照200μM吲哚美辛(IN组)分别培养24、48和72小时,收集细胞提取蛋白,Werstern blot方法检测各组p-ERK1/2和总ERK1/2蛋白的表达。结果(1)川芎嗪可抑制A549细胞的增殖活性,其作用呈时间和剂量依赖性。根据结果,选取200,400和800μg/ml川芎嗪进行下一步的实验；选取对A549细胞增殖活性没有明显影响的200μg/ml川芎嗪进行细胞侵袭实验。(2)川芎嗪培养组Go-G1期的细胞比率较对照组明显增多,使相应S期细胞比率减少。川芎嗪对A549细胞周期的阻滞作用呈剂量依赖性。(3)川芎嗪可抑制A549细胞中p-ERK1/2的蛋白表达,其作用呈时间和剂量依赖性。结论(1)川芎嗪可抑制A549细胞的增殖,其作用呈时间和剂量依赖性。(2)川芎嗪可通过阻滞A549细胞于细胞周期的Go-G1期而抑制其增殖。(3)ERK是川芎嗪抑制A549细胞增殖的机制之一。第二部分川芎嗪对人肺癌A549细胞侵袭转移的作用研究目的(1)体外细胞实验观察川芎嗪对A549细胞侵袭力的影响；(2)体内动物实验观察川芎嗪对A549细胞远处肺转移的影响。方法(1) Transwell侵袭实验检测川芎嗪对A549细胞侵袭能力的影响：在底部铺有Matrigel的Transwell小室中,A549细胞和200μg/ml川芎嗪组培养24小时,穿越至Transwell小室底部的细胞固定、染色、计数,和对照组比较统计细胞数的变化。(2) ELISA方法检测川芎嗪对A549细胞MMP-2/TIMP-2分泌水平的影响：A549细胞分别和200μg/ml川芎嗪(TMP200),400μg/ml川芎嗪(TMP400),800μg/ml川芎嗪(TMP800),阳性对照200μM吲哚美辛(IN)以及空白对照培养液分别培养24小时,收集各组的培养上清液,ELISA方法检测各组MMP-2/TIMP-2的浓度。(3)利用BALB/c裸鼠,通过尾静脉注射法建立A549细胞肺转移的动物模型。观察A549细胞在肺内转移过程,确定实验观察时间点。实验组给予腹腔注射川芎嗪100mg/kg/day,对照组给予等剂量生理盐水,每天观察裸鼠的毛发、饮食和精神状态,每4天称重,28天后杀死裸鼠取肺,计数裸鼠肺表面转移瘤的数目；H&E染色,组织学检测肺内转移瘤的情况。结果(1)川芎嗪对A549细胞侵袭力的影响：A549细胞与200μg/ml川芎嗪共培养24小时后,穿越过Transwell小室基底膜的细胞数与对照组相比明显减少,表明川芎嗪对A549细胞的侵袭力具有明显的抑制作用。(2)川芎嗪对A549细胞分泌MMP-2/TIMP-2的作用：培养24小时后,TMP200, TMP400和TMP800组MMP-2/TIMP-2的水平较对照组均有显著意义的降低,表明川芎嗪对A549细胞分泌MMP-2/TIMP-2具有抑制作用。抑制作用随川芎嗪剂量的增加而增强。(3)川芎嗪对A549细胞远处肺转移的作用：通过尾静脉注射法可成功建立裸鼠肺转移的动物模型。通过观察A549细胞在肺内转移过程,选用经尾静脉注射A549细胞后第29天作为获取裸鼠肺组织的时间点。川芎嗪治疗组A549细胞肺转移瘤的数目和大小较对照组均明显减少。除了可很快缓解的局部刺激症状,川芎嗪治疗组裸鼠的精神状态和体重较对照组无明显差别。结论(1)川芎嗪对人肺癌A549细胞的侵袭力具有明显的抑制作用。(2)川芎嗪能够抑制A549细胞的体内肺转移,并表现出较低的毒副作用和较好的安全性。(3)首次提示MMP-2/TIMP-2可能是川芎嗪抑制A549细胞侵袭的作用机制之一。第三部分川芎嗪对人肺癌A549细胞COX-2的作用研究目的分别从酶活性、蛋白表达、代谢产物和组织水平,观察川芎嗪抑制肺癌A549细胞侵袭转移过程中COX-2的变化,探讨COX-2在川芎嗪抑制肺癌侵袭转移中的作用。方法(1)COX-2酶活性的检测：A549细胞分别和200μg/ml川芎嗪(TMP200),400μg/ml川芎嗪(TMP400),800μg/ml川芎嗪(TMP800),阳性对照200μM吲哚美辛(IN)以及空白对照培养液分别培养24小时,收集细胞,超声破碎细胞,提取上清液,采用COX酶活性荧光检测试剂盒测定各组酶活性。(2)Western blot方法检测A549细胞中COX-2的蛋白表达：上述各组细胞分别培养24小时,收集细胞,提取蛋白,采用Western blot方法检测各组A549细胞中COX-2的蛋白表达。(3)放射性免疫测定A549细胞培养上清液中PGE2的浓度：上述各组细胞分别培养24小时,收集上清液,放射性免疫法测定各组PGE2的浓度。(4)免疫组化方法检测A549细胞肺转移瘤组织中COX-2的表达。结果(1)川芎嗪对A549细胞COX-2酶活性的影响：A549细胞经川芎嗪培养24小时后,与吲哚美辛组一样,TMP200, TMP400和TMP800组COX-2的酶活性较对照组均明显下降,但各川芎嗪组间未表现出明显差异。(2)川芎嗪对A549细胞中COX-2蛋白表达的影响：培养24小时后,IN组COX-2的蛋白表达较对照组减弱；而各川芎嗪培养组COX-2的蛋白表达和对照组相比无明显差别,提示川芎嗪对A549细胞中COX-2的蛋白表达无明显影响。(3)川芎嗪对A549细胞分泌PGE2的影响：A549细胞与200μM吲哚美辛(IN)培养24小时后,细胞上清液中PGE2的浓度较对照组明显降低。与IN组相似,各川芎嗪培养组PGE2的浓度较对照组均明显降低,差异具有显著性(p<0.05)。TMP200、TMP400和TMP800各组间未表现出明显差别。(4)川芎嗪对A549细胞肺转移瘤组织中COX-2表达的影响：川芎嗪治疗组裸鼠肺转移瘤COX-2染色阳性细胞和颗粒颜色均较对照组明显降低。结论(1)川芎嗪可抑制A549细胞中COX-2的酶活性和肺转移瘤组织中COX-2的表达,对A549细胞中COX-2的蛋白表达无明显影响。(2)COX-2是川芎嗪抑制肺癌侵袭转移的重要作用靶点之一。3.研究的限制性本研究初步只观察了川芎嗪对肺癌A549这一个细胞系的作用,关于COX-2介导的川芎嗪抑制NSCLC侵袭转移的作用,还需进一步利用更多的NSCLC细胞系进行观察,以使结果更为翔实。4.研究创新点(1)通过细胞实验和动物实验观察了川芎嗪对肺癌A549细胞的作用,结果显示川芎嗪能够抑制A549细胞的增殖,并在更低的浓度和更早的时间显示出更为突出的抗肿瘤侵袭作用。(2)首次观察了川芎嗪对肺癌A549细胞COX-2的作用,结果显示川芎嗪能够抑制A549细胞COX-2的酶活性和转移瘤组织中COX-2的表达。(3)首次揭示了COX-2是川芎嗪抑制肺癌A549细胞侵袭转移的重要作用靶点之一。5.意义本研究首次揭示了川芎嗪以COX-2为靶点的抗肿瘤作用,对川芎嗪抗肿瘤作用的分子机制进行了新的阐述,为进一步的研究提供了思路,为川芎嗪在肺癌防治中的进一步临床应用研究提供理论依据。