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酶联免疫吸附分析（Enzyme linked immunosorbent assay,ELISA）是基于抗原-抗体之间的特异性结合来检测目标物（药物、激素、蛋白质、微生物等）的一种分析方法,具有特异性强、灵敏度高、简单快捷、分析容量大等优点。目前,信号检测主要有比色、荧光、电化学、化学发光等方法,因为比色分析方法不需要复杂的仪器、肉眼可直接进行半定量分析而受到广泛关注。在比色分析方法中,常用的显色底物有3,3’,5,5’-四甲基联苯胺（TMB）、3,3’-二氨基联苯胺（DAB）、邻苯二胺（OPD）、4-硝基苯磷酸二钠（PNPP）等,但是这些物质具有难溶于水、毒性大、昂贵等缺点,限制了其在显色分析方法中的进一步应用。开发新的显色体系来克服传统底物的缺点是提高ELISA检测性能以及拓展其应用领域的有效途径。经过研究者们不懈努力,许多纳米材料（纳米金、纳米银等）被成功合成并用于显色分析,但这些纳米材料易受电解液、pH、温度等因素的影响。因此,开发简单、快速、稳定的显色体系及操作简单的检测方法迫在眉睫。此课题基于酶的高催化活性建立了两种新型酶联显色体系,有效克服了传统显色体系的缺点,并基于新型显色体系构建了高性能比色免疫分析方法,进一步证实了其在实际样品检测中的应用潜力。论文的主要研究内容和结果如下:1.GOx介导的碘-淀粉显色体系的构建及其在高灵敏酶联免疫分析中的应用在本部分工作中,显色体系的机理是氧化性过氧化氢（H2O2）将碘化钾（KI）中的碘离子氧化成单质碘（I2）,而I2与淀粉进行络合反应,生成水溶性蓝黑色I2-淀粉络合物,从而可实现肉眼半定量、紫外定量分析H2O2。进一步将此显色方法用于免疫分析,实验中我们选取了前列腺特异性抗原（Prostate specific antigen,PSA）作为模型蛋白进行分析检测。具体如下:首先利用抗体-抗原之间的特异性识别捕获待测样品中的目标分子PSA,其次加入生物素偶联的示踪抗体,形成捕获抗体-PSA-示踪抗体的三明治夹心结构,再利用生物素与亲和素的特异性识别作用引入葡萄糖氧化酶（Glucose oxidase,GOx）。在GOx的催化下,葡萄糖（Glucose,Glu）被氧化生成葡萄糖酸和H2O2,在KI-淀粉显色液存在时生成蓝黑色I2-淀粉络合物进行显色。络合物颜色的深浅依赖于PSA的浓度,浓度越大,颜色越深。因此,通过所构建的酶联显色体系,成功的将不可测量的PSA浓度信号转换成了可测量的蓝黑色I2-淀粉络合物的颜色/吸光值信号,实现了PSA的肉眼半定量检测和基于吸光值的定量检测。实验结果显示:PSA的动态检测范围为0.1 pg mL-1至1μg mL-1,最低检出限（Limit of detection,LOD）为0.46 pg mL-1,实现了对PSA的快速、超灵敏、低成本的分析检测。2.ALP介导的络合显色和级联信号放大效应的高性能比色免疫分析方法的构建和应用本工作开发了一种基于金属离子螯合的颜色生成和碱性磷酸酶（Alkaline phosphatase,ALP）催化的级联信号放大的新型显色体系。具体如下:ALP催化L-抗坏血酸-2-磷酸酯（L-ascorbic acid-2-phosphate,AAO）水解成还原性抗坏血酸（L-ascorbic acid,AA）,AA将显色液中的金属离子Cu2+还原成低价态Cu+,进而原位产生紫色的水溶性Cu（I）-BCA螯合物,形成的紫色螯合物具有良好的水溶性,由于配体至金属电荷转移（LMCT）效应,螯合物在562 nm显示出强烈的吸光特性,其吸收值与ALP的量成正比关系。在最优实验条件下,ALP检测的线性范围为0.001-0.5 U mL-1,最低检测限达到0.001 U mL-1,证实了该酶联显色体系的可行性和卓越性能。本工作进一步以兔IgG为模型目标物,构建了三明治夹心免疫分析方法,并对该方法的可行性和性能进行了验证。当目标物兔IgG存在时,通过抗原-抗体之间的特异性结合形成抗体-兔IgG-抗体三明治免疫复合物,再利用生物素与亲和素的高效识别作用,将ALP引入到酶标板对应的孔中。所引入的ALP的量和目标物的浓度成正相关关系,因此兔IgG的检测就转化为ALP的检测,进而实现比色免疫分析。实验结果显示,在模拟血清样品中所构建的新型比色分析方法的线性检测范围为0.1 ng mL-1-25 ng mL-1,最低检出限为0.05 ng mL-1。为了研究其在实际检测中的应用潜力,我们选取了肿瘤标志物PSA作为模型待测物开展了比色免疫分析。实验结果显示:PSA的检测范围为0.5 ng mL-1-25 ng mL-1,最低检出限为0.38 ng mL-1,其远远低于血液中PSA的临界含量,足以满足肿瘤医学诊断领域的应用。综上所述,本课题开发了由GOx、ALP介导的两种新型显色体系,并成功实现了在模拟血清样品中的肿瘤标志物PSA的检测。与传统ELISA相比具有灵敏度高、试剂成本低、显色产物稳定等优点。且本论文所开发的比色免疫分析方法具有良好的普适性,仅通过对识别分子的调整,即可实现其他生物大分子或者小分子的检测。