【摘 要】
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背景与目的对人类遗传病的大规模分析发现,人类基因组致病性突变中最大的一类是点突变,也称为单核苷酸多态性（SNP）,由SNP导致的遗传病约占总遗传性疾病的58%。因此,基于单碱基水平的精确编辑对遗传病的研究有着至关重要的作用。单碱基编辑技术是基于CRISPR/Cas系统改造的新型基因编辑技术,它可以在不引起在DNA双链断裂（DSBs）的情况下,精确地将DNA中的一个碱基替换为另一个碱基。目前已开发的
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背景与目的对人类遗传病的大规模分析发现,人类基因组致病性突变中最大的一类是点突变,也称为单核苷酸多态性（SNP）,由SNP导致的遗传病约占总遗传性疾病的58%。因此,基于单碱基水平的精确编辑对遗传病的研究有着至关重要的作用。单碱基编辑技术是基于CRISPR/Cas系统改造的新型基因编辑技术,它可以在不引起在DNA双链断裂（DSBs）的情况下,精确地将DNA中的一个碱基替换为另一个碱基。目前已开发的单碱基编辑器包括可将胞嘧啶（C）转换为胸腺嘧啶（T）的胞嘧啶碱基编辑器（CBE）,将腺嘌呤（A）转换为鸟嘌呤（G）的腺嘌呤碱基编辑器（ABE）以及最近新开发的可进行C到G碱基颠换的CGBE。最近的两篇文章表明,将CBE的尿嘧啶DNA糖化酶抑制剂（UGI）替换为尿嘧啶DNA糖化酶（UNG）可以实现C>G转化。在本研究中,我们旨在通过优化CGBE,提高C>G转换效率,减少脱靶风险,得到OPTI-CGBE。然后系统地分析OPTI-CGBE和其他CGBE变异体的motif偏好,为sgRNA的选择提供指导。最后用OPTI-CGBE制备基因编辑小鼠,以验证该系统的实用性。方法1.通过用不同物种来源（包括人类、大肠杆菌、小鼠或线虫）的UNG替换BE3的UGI构建CGBE系统,并进一步将CGBE系统通过优化r Apobec1,增加核定位序列,优化SpCas9n的密码子,改变UNG的相对位置等构建不同CGBE系统。同时,构建不同sgRNA质粒。将CGBEs和sgRNA共转染HEK293T细胞,通过流式分选阳性细胞,然后再通过PCR扩增靶序列,经过扩增子深度测序,得到靶位置被编辑情况,进而分析不同版本的CGBEs C>G编辑效率,筛选出最佳的OPTI-CGBEs进一步通过全基因组测序和转录组测序分析OPTI-CGBE的随机脱靶风险,及通过Cas-OFFinder分析其sgRNA依赖性脱靶风险。2.对比被编辑的C位点上下游碱基对其被OPTI-CGBEs编辑情况的影响,分析OPTI-CGBEs在靶序列的motif偏好,并根据分析结果构建特异的sgRNA进行验证。构建包含不同胞嘧啶脱氨酶的CGBE变体,分析其motif偏好。构建识别“NG”PAM的CGBE变体,筛选出最佳版本。3.用OPTI-CGBEs编辑小鼠的胚胎,检验其在胚胎上的编辑效率,进一步将编辑过的胚胎移植至代孕母鼠,娩出雏鼠,检测被编辑小鼠。结果1.线虫来源的c UNG和大肠杆菌来源的e UNG构成的CGBE,在通过脱氨酶优化,融合蛋白结构域相对位置优化,密码子优化可以实现高效的C>G转换（分别为29.6%与22.7%）,我们将其称为cOPTI-CGBE（FNLS-c UNG-YE1-CGBE）和eOPTI-CGBE（FNLS-e UNG-YE1-CGBE）。且该系统脱靶风险低。2.通过对比cOPTI-CGBE和eOPTI-CGBE在“QCW”motif位点和非该motif位点的编辑效率（30.2%vs 9.5%;34.0%vs 12.1%）,发现cOPTI-CGBE和eOPTICGBE均对“QCW”motif有显著的偏好。进一步分析发现,e A3A-eOPTI-CGBE和e A3A-cOPTI-CGBE对“TCW”有显著的偏好,h A3G-eOPTI-CGBE、h A3GCTD-eOPTI-CGBE、A3G-cOPTI-CGBE和h A3G-CTD-cOPTI-CGBE对“CCN”motif有显著的偏好。Cas9n-NG和spGn的编辑效率高于x Cas9n版本。3.OPTI-CGBE在胚胎的编辑效率可达到33.2%,被操作过的胚胎移植后出生的小鼠有60%被编辑,可见OPTI-CGBE可以有效编辑小鼠胚胎,并能产生基因编辑小鼠。结论我们通过对CGBE的优化,得到了新变体,命名为OPTI-CGBE,它具有高C>G编辑效率和低脱靶风险的优点。OPTI-CGBE与相应的CBE显示出不同的motif偏好,不同类型脱氨酶的CGBE更倾向于不同的motif。我们成功地应用OPTI-CGBE有效编辑小鼠胚胎,且能制备基因编辑小鼠。OPTI-CGBE将在需要C>G编辑的应用中占有重要的地位。
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