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背景与目的:IgA肾病（IgA nephropathy,IgAN）是世界范围内最常见的慢性肾小球肾炎,其特征以IgA和补体C3为主免疫复合物沉积在肾小球系膜区或毛细血管襻区,临床表现和病理表现多种多样,不同病理表现下临床症状轻重不一,预后差异也较大。IgAN的流行病学具有明显的地理变异性,在东亚和东南亚更常见且更容易进展,在确诊后5-25年内有20-40%的患者发展成终末期肾脏病。针对IgA肾病多年来的基础研究和临床循证医学分析提示IgAN是一种免疫性疾病,虽然具体发病机制仍然未研究清楚,但免疫炎性反应可能介入了IgA肾病的发病以及疾病进展。Bruton酪氨酸激酶（Bruton’s tyrosine kinase,BTK）所编码的胞浆蛋白属于Tec家族的非受体类酪氨酸激酶,表达除T淋巴细胞和B淋巴细胞发育终末期的浆细胞以外所有的B淋巴细胞和先天性免疫细胞,是这些细胞完成抗原受体信号转导的关键激酶。近些年越来越多的研究结果揭示了BTK在先天免疫系统的单核细胞中发挥重要作用,与许多免疫相关性的疾病有着密切关联,其机制可能是通过促进自身抗体的产生以及介导髓样细胞的炎症反应而促进终末器官损害,如类风湿性关节炎、干燥综合征、狼疮性肾炎、炎症性肠病以及I型糖尿病等等。然而BTK在IgA肾病中的作用尚未阐明。巨噬细胞是一类在细胞因子,趋化因子和/或其他介质局部释放后募集到感染或组织损伤部位的免疫细胞。巨噬细胞可以吞噬病原体、T细胞抗原呈递、产生各种细胞因子等多种生理作用是通过多种表面受体（如Tol-like受体和FcγR）来发挥的,以此激活细胞内的各种信号转导产生炎症并激活更加有特异性的针对抗原的反应。Fc受体是免疫反应的重要关节点,其能够介导单核-巨噬细胞吞噬作用不受BTK抑制或Xid突变的影响,还有报道称BTK缺乏的巨噬细胞的极化能力受损。人们早已认识到B细胞活化和免疫复合物介导Fc受体活化在免疫介导的肾小球肾炎发病机制中的重要作用,通过FcγRI渠道捕获的IgA免疫复合物在肾小球被沉积被认为是IgA肾病的主要致病机制。本研究拟采用人体标本和动物模型探讨巨噬细胞Bruton酪氨酸激酶的激活对IgA肾病的作用及机制。方法:第一部分:收集2019年3月1日至2019年8月30日于安徽医科大学第一附属医院肾内科住院并且经肾活组织病理检查明确诊断为IgA肾病的患者共63例,收集肾穿刺留下的石蜡组织以及清晨空腹血作为IgA肾病组,聚蔗糖-泛影葡胺密度梯度离心法分离外周血单个核细胞（Peripheral blood mononuclear cells,PBMCs）。同期收集我院泌尿外科肾脏肿瘤术后癌旁2cm肾组织共20例作为肾脏病理对照组;选取20名健康志愿者的清晨空腹血作为临床对照组。连续切片的免疫组化（Immunohistochemistry,IHC）单双染检测IgAN组和癌旁肾组织的CD68、BTK蛋白表达量和定位情况,使用IHC和免疫印迹法（Western blotting,WB）检测肾组织和PBMCs磷酸化BTK和磷酸化NF-κB的蛋白表达情况。在IgA肾病组内比较肾小球内BTK的表达与肾脏组织补体C3b、C4d以及牛津分型,Katafuchi半定量分析以及临床指标的相关性。使用IHC、定量逆转录聚合酶链反应（Quantitative reverse transcription polymerase chain reaction,QRT-PCR）和酶联免疫吸附检测（Enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA）检测炎症因子白介素1β（Interleukin1β,IL-1β）、肿瘤坏死因子-ɑ（Tumor necrosis factor-ɑ,TNF-ɑ）、单核细胞趋化蛋白-1（Monocyte chemoattractant protein-1,MCP-1）的表达。第二部分:选取BTK全髓系敲除小鼠14只及同背景野生型小鼠14只作为研究对象,IgA肾病模型的构建方法采用口服牛血清白蛋白、皮下注射四氯化碳CCL4以及静脉注射脂多糖。上述小鼠分为四组:WT组（即野生型小鼠,n=7）,IgAN组（野生型小鼠造模成IgA肾病,n=7）,BTK-/-组（BTK敲除小鼠对照组,n=7）和BTK-/-IgAN组（BTK敲除小鼠造模成IgA肾病,n=7）。10周后在处死前一天进代谢笼采集所有小鼠的24小时尿标本,并收集记录小鼠的体重、肾重、以及血标本、肾脏组织标本。造模成功的标志为IgA免疫荧光在系膜区表现出团块状沉积同时电镜也观察到有电子致密物沉积在系膜区。小鼠尿蛋白、血尿素氮等常规生化指标的检测;光镜观察小鼠肾脏病理组织学改变;IHC的单染和双染检测CD68、BTK蛋白表达量和定位情况;IHC和WB检测磷酸化BTK和磷酸化NF-κB的蛋白表达情况;IHC、QRT-PCR和ELISA检测炎症因子IL-1β、TNF-ɑ、MCP-1的表达。结果:第一部分:免疫组化结果提示IgAN患者肾脏巨噬细胞浸润明显增加,单染提示CD68和BTK在正常肾组织中未见明显阳性表达,而IgAN患者肾小球和肾小管-间质的CD68和BTK表达明显增加（p<0.0001）;双染表明肾小球和肾小管间质中表达BTK的CD68阳性细胞数明显高于正常对照组（p<0.0001）;磷酸化BTK在IgA肾病患者的肾脏表达水平也较正常肾组织明显升高;牛津分型中,M1、E1、S1、T1-2、C1-2的CD68和BTK表达分别较M0、E0、S0、T0、C0明显增多（p<0.05）;肾小球和肾小管间质的CD68和BTK表达与Katafuchi半定量的肾小球评分、肾小管间质评分成明显正相关（p<0.05）;在IgAN组内,肾脏组织补体C3b、C4d阳性表达的患者其肾小球BTK表达明显增高（p<0.05）;肾小球BTK表达与临床指标中24小时尿蛋白、血清肌酐呈正相关（p<0.001）,与血清白蛋白呈负相关（p<0.05）;IHC、WB、QRT-PCR和ELISA的结果提示IgA肾病患者体内炎症指标明显升高,p-NF-κB p65、TNF-ɑ、IL-1β和MCP-1在IgA肾病患者的肾组织和PBMCs的表达较对照组显著增加（p<0.05）。第二部分:各组小鼠的肾重/体重比无明显差别;血尿素氮和24小时尿蛋白在IgAN组较WT组明显升高,BTK-/-IgAN组的上述两项水平也较BTK-/-组明显升高而较IgAN组明显好转（p<0.05）;光镜下,WT组与BTK-/-组的Katafuchi半定量评分无差异,IgAN组较WT组小鼠的肾小球评分、肾小管评分和血管评分均明显升高（p<0.05）,而同样状态下BTK敲除后的IgAN小鼠较BTK-/-组上述评分明显升高,较IgAN组小鼠上述评分明显下降（p<0.05）;免疫组化单染提示CD68和BTK在IgAN组肾小球和肾小管-间质的表达较WT组小鼠明显增加（p<0.05）,CD68表达在BTK-/-IgAN组较BTK-/-组明显增加而较IgAN组明显减少（p<0.05）;双染表明IgAN组肾小球和肾小管间质中BTK阳性的CD68阳性细胞明显高于WT组小鼠（p<0.05）。BTK-/-组与BTK-/-IgAN组未见BTK阳性的CD68阳性细胞。;磷酸化BTK在IgAN组小鼠的肾小球和肾小管间质内的激活较WT组明显升高（p<0.05）,在BTK-/-组和BTK-/-IgAN组小鼠肾脏中无表达;肾小球BTK表达与临床指标中24小时尿蛋白、血尿素氮呈正相关（p<0.05）;IHC、WB、QRT-PCR的结果提示IgAN组小鼠体内炎症指标明显升高,p-NF-κB p65、TNF-ɑ、IL-1β和MCP-1在IgAN组小鼠肾组织的表达较WT组显著增加,而BTK-/-IgAN组肾脏中上述炎症因子的表达较BTK-/-组明显增加而较IgAN组明显下降（p<0.05）。结论:1.在IgA肾病患者中,巨噬细胞BTK表达明显增加,且有磷酸化BTK的激活;巨噬细胞BTK表达水平与病理指标的牛津分型和Katafuchi半定量评分以及补体C3b、C4d有关,病理程度严重或者补体阳性表达的患者BTK表达更明显;肾小球内BTK表达与患者临床指标的尿蛋白、血肌酐和血白蛋白有相关性;巨噬细胞BTK可能通过激活NF-κB信号通路而介导IgA肾病炎症的发生和进展,并导致多种细胞因子的分泌。2.在动物体内实验中,IgAN小鼠的血尿素氮和尿蛋白水平明显上升,肾系膜细胞、系膜基质增生明显,肾小管间质发生萎缩和炎症细胞浸润,小动脉透明变性,而同样状态下BTK敲除后的IgAN小鼠上述表现都有明显改善。IgAN小鼠肾脏组织中发现有磷酸化的BTK激活,并激活下游的NF-κB信号通路,炎症因子TNF-ɑ、IL-1β和MCP-1水平明显增加,而BTK敲除后的IgAN小鼠肾脏中,p-NF-κB p65和炎症因子水平明显下降,提示巨噬细胞BTK激活可能参与IgA肾病肾脏炎症的发生发展。