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背景:原发性干燥综合征(Primary Sj(?)gren’s Syndrome,pSS)是一种以外分泌腺分泌功能障碍为主要表现的自身免疫病,典型症状为口、眼干燥,也可累及腺体外器官,出现多系统多器官损害症状。迄今为止,其发病机制尚不明确,尚无根治的方法,相当一部分pSS患者采用常规治疗难以控制症状。间充质干细胞(Mesenchymal Stem Cells,MSC)具有低免疫原性、多向分化潜能和免疫调节等特性,已用于多种自身免疫病的治疗。国内外已有MSC治疗pSS的实验和临床研究的报道,但具体机制仍有待进一步探讨。研究表明MSC具有调节抗原递呈细胞功能,而抗原递呈细胞产生的白介素12(Interleukin 12,IL-12)与pSS发病密切相关。目的:本研究通过观察MSC对抗原递呈细胞分泌IL-12的调控在其治疗pSS中作用,进一步探讨MSC治疗pSS的机制,为MSC的临床应用提供依据。方法:1)酶联免疫吸附法(ELISA)检测pSS患者和健康对照者血浆IL-12水平,检测pSS患者IL-12水平,并分析其与患者唇腺病理等临床指标相关性。免疫磁珠分选SS患者和健康对照外周血CD14+单核细胞,分别以M-CSF和GM-CSF+IL-4将其向巨噬细胞(Macrophage,Mφ)和树突状细胞(Dendritic Cells,DC)定向诱导分化,LPS诱导细胞成熟并刺激其分泌细胞因子,实时荧光定量PCR(Real-time Quantitative PCR,qPCR)法比较 pSS 及健康对照者单核、Mφ及DC细胞中IL-12的表达。流式细胞术检测pSS患者和健康对照外周血Th1、Th2、Th17、Treg、Tfh、B细胞、浆细胞比例,分析患者血浆IL-12水平与各淋巴细胞亚群比例的相关性。5例pSS患者行人脐带MSC(Umbilical Cord Derived MSC,UCMSC)移植,移植前及移植后一周分别抽取全血,分离血浆,ELISA检测移植前后IL-12变化。2)将雌性pSS动物模型鼠-NOD小鼠随机分为对照组、IL-12处理组和IL-12单克隆抗体处理组,分别腹腔注射磷酸盐缓冲液(PBS)、重组鼠IL-12和抗鼠IL-12单克隆抗体。3周后检测小鼠唾液流率,处死小鼠,取颌下腺、泪腺、肺、肾和肝等组织,进行HE染色分析。3)将雌性NOD小鼠随机分为UCMSC移植治疗组、人滑膜成纤维细胞(Fibroblast-Like Synoviocyte,FLS)移植组和PBS对照组,分别尾静脉注射106细胞/只和PBS。4周后处理小鼠,处理方法同上。磁珠分选小鼠脾脏CD11c+DC细胞及CD11b+单核-巨噬细胞,提取RNA,qPCR检测细胞IL-12的表达。4)取C57BL/6小鼠脾脏,磁珠分选CD11c+及CD11b+细胞,分别与UCMSC共培养,24小时后qPCR检测细胞IL-12的表达。诱导健康对照CD14+单核细胞成DC细胞,与UCMSC共培养24小时,qPCR检测DC细胞IL-12的表达。收集与单核、巨噬或DC细胞共培养的UCMSC,并提取其RNA,检测CD40、CD40L、CD137、4-1BBL、IFN-α、IFN-β、IFN-γ和 C5 功能分子的表达。结果:pSS患者血浆IL-12水平以及单核、巨噬和DC细胞IL-12的表达均较健康对照显著升高,且唇腺组织淋巴细胞浸润严重组较浸润轻微组患者IL-12水平升高。pSS患者外周血Th1、Th17、Tfh细胞和浆细胞比例较健康对照组显著增多,而Treg细胞比例降低,且Th1细胞比例与患者血浆IL-12水平正相关。动物实验显示,注射重组IL-12的NOD小鼠,唾液流率显著降低,颌下腺肿胀明显,颌下腺淋巴细胞浸润明显增加,肺支气管周围、肾间质及肝小胆管周围出现大量淋巴细胞浸润;而IL-12单克隆抗体处理的NOD小鼠Th1、Tfh、Th17细胞比例及绝对数显著降低,颌下腺、肺、肾脏及肝脏淋巴细胞浸润明显改善。临床研究显示,pSS患者行MSC移植后1个月,其血浆IL-12水平明显减低。MSC移植治疗pSS动物模型NOD小鼠结果显示,与FLS细胞组相比,MSC移植治疗组NOD小鼠唾液流率增加,脾脏Th17、Tfh细胞比例减少,Treg、Tr1细胞比例增加。NOD小鼠MSC移植治疗1个月后,其CD11c+DC和CD11b+单核-巨噬细胞表达的IL-12显著减少,血浆IL-12水平显著降低。进一步体外研究结果显示,MSC体外可显著抑制小鼠CD11c+DC和CD11b+单核-巨噬细胞IL-12的表达。人THP-1单核细胞与MSC共培养后,THP-1细胞表达的IL-12显著减少,MSC表达CD137水平显著升高;THP-1诱导的巨噬细胞与MSC共培养后,其表达的IL-12显著减少,MSC表达CD40水平显著升高;人单核细胞来源DC与MSC共培养后,其表达的IL-12显著减少,MSC表达CD40L水平显著升高。结论:pSS患者血浆IL-12水平及抗原递呈细胞IL-12的表达存在异常,并与体内淋巴细胞亚群、唾液腺淋巴细胞浸润以及临床指标密切相关;动物实验表明IL-12能够加重NOD小鼠的病情,而阻断IL-12可以改善淋巴亚群的比例减轻NOD小鼠的病情;MSC移植可以改善干燥综合征症状,调节淋巴细胞亚群,降低血浆IL-12水平,抑制抗原递呈细胞IL-12的表达。这些发现提示,MSC可能通过抑制抗原递呈细胞产生的IL-12进而纠正淋巴细胞亚群来治疗pSS。