丹参(Salvia miltiorrhiza Bunge)是我国传统中药,以根及根茎入药,主要活性成分为丹酚酸类和丹参酮类物质,能有效预防和治疗心脑血管疾病。随着栽培规模扩大,药材品质下降问题日益严重,阐明活性成分生物合成的调控机制,可为药材品质提升奠定理论基础。茉莉酸(JA)可以显著增加丹参活性成分含量,且JA信号转导主要以JA-Ile(茉莉酸异亮氨酸)活性形式与受体结合,JA-Ile被羟基化修饰生成的12OH-JA-Ile与受体结合能力极低,因此会极大地削弱JA信号。本研究拟克隆催化JA-Ile生成12OH-JAIle的关键酶基因,通过遗传转化分析其对丹参活性成分积累的影响。研究结果如下:1.参考丹参基因组数据库,基于同源克隆法,通过比对拟南芥At CYP94B3(催化JAIle生成12OH-JA-Ile),克隆了丹参SmCYP94B50,其CDS长1518bp,编码505个氨基酸,与At CYP94B3氨基酸同源性61%;进化树分析表明,与SmCYP94B50同源性最高的是葡萄和蒺藜苜蓿的CYP94B3。2.组织特异性分析表明,SmCYP94B50在茎、叶中的表达量较高,在根中较少;外施Me JA和低温处理可诱导SmCYP94B50表达;亚细胞定位试验表明,SmCYP94B50定位在叶绿体。3.克隆了SmCYP94B50的启动子2005bp,分析发现其启动子上具有响应光、赤霉素、脱落酸和茉莉酸等多种顺式作用元件,暗示该基因的转录可能受到环境和多种激素的调控。4.为了验证SmCYP94B50的功能,利用发根农杆菌和根癌农杆菌介导的遗传转化,得到了丹参SmCYP94B50过表达和RNA干扰的转基因植株和毛状根。其中,过表达植株侧枝增多,茎节较长且细,RNA干扰植株则表现为茎缩短且粗,根系粗壮;过表达毛状根分枝较多,而RNAi毛状根则根系粗壮且生长缓慢。HPLC分析过表达毛状根中丹酚酸的含量,结果表明,过表达毛状根的迷迭香酸和丹酚酸B的含量与野生型相比显著降低,表明SmCYP94B50负调控丹酚酸的生物合成。